利用病毒介导沉默技术高通量鉴定马铃薯晚疫病水平抗性相关基因功能-蔬菜学专业论文.docxVIP

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 噶 如需保密，解密时间 年 月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果．尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均巴在论文中做了明确的说明，并表示了谢意． 研究生签名： 巷呻 时阃： 国If年石月j3日 榭铭：勘中 撇名：炒霉 签名日期： 却11年‘月砖日 签名日期：Z痧，，年多月◆乡匿 注：请将本表直接裴订在学位论文的扉页和目录之间 利用病毒介导沉默技术高通量鉴定马铃薯晚疫病水平抗性相关基因功能目 利用病毒介导沉默技术高通量鉴定马铃薯晚疫病水平抗性相关基因功能 目 录 摘要 ．I ABSTRACT II 缩略词表 1 、蒇言1月U舌 。1 1．1马铃薯晚疫病及其抗病分子机理 1 1．1．1马铃薯晚疫病及其危害 1 1．1．2马铃薯晚疫病菌 ．1 1．1．3马铃薯晚疫病抗性分子机理 ．．2 1．2病毒诱导基因沉默现象与VIGS技术 4 1．2．1病毒诱导基因沉默的发现 4 1．2．2 VIGS技术的原理与研究进展 4 1．2．3ⅥGS技术的优点与不足 ．．8 1．3本课题的提出及研究内容 9 2材料与方法 1 l 2．1植物材料、晚疫病病原菌、菌株和质粒 ．1 1 2．2目标基因EST片段的选择与克隆 11 2．3瞬时干涉沉默载体构建 ．13 2．3．1质粒酶切及目标片段连接 l 3 2．3．2大肠杆菌热击感受态制备及转化 。14 2．3．3载体酶切检测与测序 ．．15 2．3．4农杆菌电击感受态细胞的制备及转化 。15 2．4 TRV病毒介导的VIGS瞬时沉默体系 ．．16 2．4．1根癌农杆菌菌液制备 ．．16 2．4．2 TRV病毒介导VIGS根癌农杆菌注射法 ．．16 2．5实验处理植株内源基因RT-PCR表达分析 16 2．6晚疫病原菌的繁殖与接种 ．16 2．6．1燕麦培养基配置与病原菌繁殖法 16 2．6．2病原菌块茎薄片繁殖法 17 2．6．3晚疫病接种鉴定方法 。17 3结果与分析 18 文挑选结果 文 挑选结果 l 8 l 8 l 9 ：1 1 23 ：!zI ．． ． ． ． ．． ．．：Z6 ：18 ． ． ．． ． ． ． ．．：18 S实验的影响 28 4．1．2环境与苗龄对VIGS实验的影响 28 4．2利用VIGS技术在本氏烟草进行高通量基因功能鉴定 ．．29 4．3马铃薯晚疫病水平抗性重要侯选基因 。29 参考文献 ．3 1 致 谢 ．38 附录1引物信息 39 附录2 TRV重组载体测序 42 附录3 2010年5月马铃薯基因病毒诱导沉默接种P．INFESTANS混合生理小种3天 利用病毒介导沉默技术高通量鉴定马铃薯晚疫病水平抗性相关摹因功能摘要 利用病毒介导沉默技术高通量鉴定马铃薯晚疫病水平抗性相关摹因功能 摘要 病毒诱导基因沉默(Virus．induced gene silencing，VIGS)技术是一种RNA介导 的植物抗病毒防御反应机制，VIGS实验技术应用在基因功能研究和高通量基因组研 究中能够高效快速的鉴定基因功能缺失后表观性状改变。 马铃薯晚疫病水平抗性是一种由微效多基因控制的，具有非小种专化性的数量 抗性。其抗病程度虽然不及垂直抗性，但是对很多生理小种均有抗性，并且有着多 重的抗病机制，具有广谱性、持久性和稳定性，同时能够降低晚疫病生理小种的选 择压力，一定程度上延缓病原菌的变异。为了解晚疫病水平抗性的分子基础，明确 水平抗性形成过程中相关基因在抗性网络中的位置与重要性，本研究挑选马铃薯晚 疫病水平抗性相关基因，在本氏烟草利用VIGS技术沉默目标基因，对目标基因沉 默烟草进行晚疫病抗性鉴定，筛选沉默后晚疫病抗性显著降低的目标基因作为马铃 薯晚疫病水平抗性重要侯选基因。主要实验结果如下： 1．挑选晚疫病水平抗性相关基因，与本氏烟草cDNA数据库比对得到45个与 本氏烟草同源性较高，并且含有23bp以上连续匹配序列的ESTs作为实验筛选的目 标基因片段。 2．根据已知序列设计引物扩增获马铃薯cDNA，扩增获得38个目标基因片段， 构建了TRV病毒重组载体，并将其转入农杆菌GV3101。 3．在本氏烟草材料用VIGS技术将与目标基因同源性较高的内源基因进行沉 默。RT-PCR技术鉴定了部分本氏烟草内源目标基因沉默效果，确定VIGS实验体系 能够达到沉默烟草内源目标基因的目的。 4．将沉默目标基因的本氏烟草进行晚疫病抗