流感病毒寡核苷酸检测芯片的初步研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

硕士学位论文流感病毒寡核苷酸检测芯片的初步研究 硕士学位论文 流感病毒寡核苷酸检测芯片的初步研究 硕士研究生；徐秋林 指导教师：马文丽教授 郑文岭教授 摘要 流行性感冒是一种由流感病毒引起的上呼吸道传染病。流感极易在人群中传 播并造成大流行。历史上每一次流感的大流行都会造成成千上万人死亡。流感 病毒分为甲、乙、丙三型，甲型流感又包含15个血凝素亚型和9个神经氨酸酶 亚型。其中，常引起人群发病的是甲型流感病毒中的H1N1和H3N2以及乙型流 感病毒。流感病毒基因为分节段的单负链RNA，其中甲型和乙型包含8个RNA 节段，丙型包含7个RNA节段，缺少神经氨酸酶节段。在这8个RIgA节段中， 编码核蛋白(nucleoprotein，NP)和膜蛋白(matrix protein，MP)的节段具有型 特异性，NP还是流感病毒分型的依据；甲型流感病毒中血凝素(hemagglutinin，HA) 和神经氨酸酶(neuraminidases，NA)极易变异，具有亚型特异性，是甲型流感病 毒亚型划分的依据。 目前流感病毒的检测方法主要有病毒分离法、血清学检测、流感病毒抗原检 测和多重PCR检测方法。无论是哪一种检测方法，都无法同时对众多型和亚型 的流感病毒进行精确的分型。因而有必要寻找一种高效、高通量和快速的流感 病毒检测和分型方法。基因芯片技术的出现为同时对流感病毒进行检测和分型 提供了可能的途径。它可以同时对成千上万个基因进行检测，因而是一种高通 量、平行化的检测方法。 摘要基因芯片根据探针类型分为cDNA芯片，DNA芯片和寡核苷酸芯片，近年 摘要 基因芯片根据探针类型分为cDNA芯片，DNA芯片和寡核苷酸芯片，近年 来的研究表明，寡核苷酸芯片比eDNA芯片和DNA芯片有着更高的特异性，同 时其灵敏度也能满足目前病原体检测的要求。寡核苷酸芯片的制作既可以采用 芯片上原位合成短的寡核苷酸探针的方法，也可以采用合成仪人工合成 15～80mer的寡核苷酸探针然后固定在支持物上的方法制备。这两种方法中，后 者相对简单易行，且系统的开放性较好。而在探针的长度的选择上，60mer的寡 核苷酸探针被认为能取得特异性和灵敏度之间的平衡，并且多数情况下只需一 个探针即可检测一个基因。 本课题用oli906．0软件针对流感病毒的NP、MP、HA和NA基因设计了77 条60mer的寡核苷酸探针。为了保证设计的探针具有高度的特异性和灵敏度， 设计时使探针Tm值在85±5℃之间，GC含量介于40％一一60％，且探针内部和探 针之间不易形成稳定的二级结构。在Blast比对中，与其它基因的同源性小于 70％，连续相同碱基的数量不超过18个。寡核苷酸探针合成和纯化后，用芯片 打印仪固定在玻片上。随后，从省CDC取回的甲型流感病毒株HINI、H3N2 和乙型流感病毒株中提取RNA，逆转录后以限制性显示(Restriction Display,RD) 技术进行荧光标记后与芯片杂交，并根据杂交结果筛除与相应本型流感病毒样 品的杂交信号的信噪比低于2，以及与其它型流感病毒样品杂交的信嗓比高于 1．5的寡核苷酸探针，得到33条高灵敏度、高特异性的寡核苷酸探针。 为了提高芯片的特异性和灵敏度，我们还对标记方法、片基和杂交条件等进 行优化。 1．标记方法的优化本部分研究比较了通用引物联合标记(Universal Primer Labeling，UPL)、RD直接标记、RD间接标记和随机引物逆转录标记这四种方法 的标记效率和可重复性，将流感病毒RNA分别用四种标记方法处理后与流感病 毒寡核苷酸检测芯片杂交，用SPSSl0．0对杂交结果进行分析。结果表明UPL方 法在标记物杂交的荧光强度、信噪比、探针真阳性率和可重复性等方面均高于 随机引物逆转录掺入标记法，而与其它两种RD标记方法相当，但标记过程相对 11 硕士学位论文 硕士学位论文 简单。 2．片基的选择本部分研究对Coming、多聚赖氨酸包被的DAKO玻片和多 聚赖氨酸处理的显微镜载玻片这三种片基进行了评估。将荧光标记的绿色荧光 蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因的寡核苷酸探针分别打印在这三种片 基上，并按常规方法进行洗脱，GenePix 4100A扫描后用GenePix 6．0软件分析 点的大小、荧光强度和背景荧光强度，以此来衡量3种片基的均一性和固定效 率，并通过不同浓度梯度的60mer寡核苷酸探针的杂交实验来衡量片基对杂交 效率的影响。结果显示，3种片基的均一性都较好，丽多聚赖氨酸包被的DAKO 和Coming芯片的固定效率和杂交效率优于国产芯片。研究认为多聚赖氨酸包被 的DAKO片基性能优异，价格便宜，适合于大规模的基因芯片研究。 3．优化杂交温度，杂交时间和杂交液等条件。结果表明，杂交温