沙门氏菌荧光PCR快速检测方法的建立与应用-微生物学专业论文.docxVIP

中文摘要就全球范国蔼言，沙门氏菌是引起缁藩褴食物中毒最常觅豹致病菡。传统的沙 中文摘要 就全球范国蔼言，沙门氏菌是引起缁藩褴食物中毒最常觅豹致病菡。传统的沙 门氏藏检测方法邋常需时4—7天，显操佟繁琐，难以应对食物中毒豹快速诊颟懿及 食品企业茅爨管理部fj对食品安全的实时监控。这裁对骚究涉fj琵藩快速捻测方法提 出了要求。 熙前沙门氏麓快速检测方法多采耀免疫学方法、核酸分子杂交以及聚合戆链式 反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)等方法，其中PCR方法越米越被广泛 用于沙门氏菌的检测。但常规的PCR检测方法普遍存在麓PCR产物污染、特异性 不高及速度慢(需电泳染胶)等缺陷。荧光PCR技术是一种新近发展起来的检测技 术，它的应用将从根本上解决这些问题。 本研究采用分子信标技术和TaqMan。MGB技术，建立了两种针对沙门氏荫的特 异性爱光PCR检测方法，并初步运用于旆床诊断和食品污染调查。实验结果如下： 1．沙门氏菌荧光PCR检测体系的建立 (1)研究6种增蓠液对荧光PCR反应的影响，选择SC(亚硒酸艋胱氨酸)增菌液 为最往培养沙门蓍黾菌静增菌液。建立快速简便的祥品前处理方法。 (2)摄撂沙门氏慧属特异性蒸N invA设计了因对弓i物，并和Rahn设计的弓l物同时 检测大量沙}j琵蘸及{§涉门氏菡蓠株，选雳了其中一对特异豫最强酌颛弓；裙。 (3)在这对引物阉选择一段舞核萤酸彦列，嚣裁分别用FAM稻MGB标记，饶纯 反应条件，建立沙门氏蕊TaqMan，MGB捻测方法。 (4)在这对引物间选择另一段寡核萤骏序列，两端冬艇上6bp豆替的寡挨萤酸形戏 分子信标，优化反应条件，建立沙门氏菌分予信标检测方法。 2，沙门氏菌荧光PCR检测体系的评价 (1)特异性：用遮两种荧光PCR方法分别检测200株沙门氏菌属菌株，均呈阳性； 检测200株非沙门氏菌属菌株，均呈阴性。 (2)灵敏度：戳鼠伤寒沙门氏菌为实验菌株(40循环)。对于DNA抽提物， TaqMan—MGB方法的稳出限为69fg／PCR体系，分子信标方法的检出限为346fg／PCR 体系；对于菌液，TaqMan-MGB方法和分子信标方法的检出限均为2efu／PCR体系； 对于食品样品，TaqMan—MGB方法和分子信标方法的检出限均为2efu／259样品。 (3)抗干扰髓：爱应不受其镪杂胬的干扰，食品样品经处理衙对反应无影响。 (4)逶复性：平行实验熬结巢～致性离，可囊复往强。 3，沙fl氏蓥荧光PCR检测体系懿应雳 (1)对深圳市痰蘩枣场匏生宠、熟食进行撼鸯，200份生岗样瀑中，荧光PCR方法 和传绞方法均为阳性的为32份，荧光PCR阳性恧传绞方法弱牲黪为33给。 (2)对食品扶鼗久员豹黢拭子灞奁中，300傍群潞瑶荧光PCR方法蟊传统方法麓畜 (2)对食品扶鼗久员豹黢拭子灞奁中，300傍群潞瑶荧光PCR方法蟊传统方法麓畜 3份检出阳性，符合率100％。 (3鳃麓蛙食貔中毒魏抉速诊断：45份撰品爱荧光PCR方法强健统方法均检出28 份沙门氏菌阳性，符合率100％。 本研究在N内首次建立了以分子信撂细TaqMan-MGB方法为基础瓣沙门氏蓝 焚光PCR检测方法，并应用于食品污染调查和食物中毒的诊断，能达到快速准确检 测沙门氏菌的目的。建立的荧：比PCR方法可作为现有国家标准检测方法的有力补充， 运用于l商床检验工作和食晶卫生濂控，掇高现有检测方法的准确度和灵敏度。 关键词：沙门氏落荧光PCR检测分子信标Taqman—MGB AbstractSaImonella Abstract SaImonella remains a major cause of foodborne illness in humans worldwide． Traditional methods for isolating and identifying Salmonella take approximately 4-7 days． Development of rapid detecfon assays for Salmonella would enable official agencies and foed indus扛ies to identify contaminated foodstuffs and other samples in a timely manner． Mere recently,a number of alternative methods for detection of Salmonella have been developed including immunoassays，nucleic acid hybridization and polymeras