课件：ORCH检测方法.pptVIP

当温度突然降低时由于模板DNA的分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA的量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA之间互补的机会较少。③ 引物的延伸：在DNA聚合酶和四种脱氧核糖三磷酸底物及Mg2存在的条件下，模板-引物结合物，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。以上三步为一循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板。这样反复循环以上反应过程就能将待测目的基因数量呈指数倍数扩增放大几百万倍。 PCR产物可用凝胶电泳分析法分析结果。常用的是琼脂糖凝胶电泳，在配制琼脂糖时加入0.5μg/ml的溴化乙锭（EB），或在电泳后凝胶用电泳缓冲液配制的同样浓度的EB液染色15-30min，紫外灯下观察结果并拍照记录。 我们实验室采用的是实时荧光定量PCR方法，常规PCR存在着不能定量和产物污染假阳性等问题，使其临床应用受到限制。实时荧光定量PCR就是利用荧光信号检测整个PCR扩增过程，获得在线描述PCR过程动力学曲线。其原理是在常规PCR扩增体系中，加入一个与靶基因序列特异互补的双荧光标记探针。探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。当探针完整时，由于淬灭基团的淬灭作用，荧光报告基团不能产生荧光发射。 当有靶基因存在时，在PCR的复性延伸期，标记探针即与靶基因互补结合，新合成链从引物开始，沿膜板延伸，当新链延伸至标记探针结合部时，DNA聚合酶具有5’—3’的外切酶活性，将探针5’端荧光报告基团切下。从而，荧光报告基团淬灭作用被解除，产生荧光发射。通过荧光光谱分析仪连续不断地检测反应体系中的荧光信号的变化。 其定量原理是：首先根据PCR扩增过程中，产物信号（荧光）尚未出现前本底荧光信号平均值加3个标准差确定为荧光阈值。在PCR反应中设置原始已知定量膜板管进行扩增，这样不同定量膜板管经过不同循环次数达到荧光阈值，此时的循环次数(Ct值：也称循环阈值) 就被记录下来。该循环参数和PCR 体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系，根据循环参数Ct 值就可以准确计算出起始DNA的数量。即能得出待测样品原始膜板的数量，从而实现样品膜板的定量。 荧光定量基因扩增技术的优点是特异性强，克服了假阳性的主要来源，可准确定量出低至1个拷贝/微升的病原体，真实地反映了病人体内病毒存在与复制的情况，可减少血清学所致的假阴性诊断。 2、结果分析 病原体DNA或RNA的存在是病原体体内复制的直接标志，可用于确定病原体感染。 阳性定量范围为103 —109 copies/ml，＜103 copies/ml为阴性。 谢谢 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 可编辑 可编辑 TORCH感染检测方法与结果分析 1971 年Nahmias 等首先描述了病原体感染对胎儿的致畸作用，他将数种能引起孕期宫内感染，甚至造成先天缺陷或发育异常的病原体英文名词的第一个字母组合而成“TORCH”，即弓形虫 ( TOX) 、风疹病毒(RV) 、巨细胞病毒(CMV) 、单纯疱疹病毒(HSV)、其他(OTH)。其他病原体感染包括细小病毒（B19）、沙眼衣原体（CT）、解脲支原体（UU）等。近几年人乳头瘤病毒（HPV）、淋球菌（GC）感染率明显上升，也引起学者重视。 孕期TORCH感染通常无症状，但对胎 儿可造成危害，可导致自然流产、胎儿畸 形、死胎、胎儿生长受限（FGR）、早产及 新生儿疾病等严重并发症。虽然TORCH感染 对胎儿、新生儿能够产生不利影响，但经 积极治疗后再次受孕仍可分娩正常婴儿。 因此在孕前监测TORCH 感染，争取在孕前 进行干预，选择适宜的妊娠时机受孕，可 减少不良妊娠结局的发生，对减少先天性 感染儿及病残儿的出生极为重要。 TORCH感染临床检测最常用的方法包括两种： TORCH抗体的检测 TORCH病原体的检测 一、TORCH抗体检测方法与结果分析 1、检测方法 用于测定液体标本中的微量物质，最常用的是免疫标记技术，是指用荧光素、酶、放射性同位素、发光剂或电子致密物质标记抗体或抗原后进行的抗原抗体的反应。这类检测技术的优点是特异、灵敏、快速、能够定性和定量、易于观察结果等。我们实验室检测TORCH抗体采用的方法是酶免疫测定中的酶联免疫吸附试验（ELISA），它是用酶标记抗体或酶标记抗抗体进行的抗原抗体反应。 （1）标本采集和处理 病人无需空腹，通过无菌性静脉穿刺采集自凝血样本2ml，离心后留取血清，最好是新鲜血清用于测定，如不能立即测定可保存于-20℃，不能反复冻融。溶血、高