利用aAPC制备pMHC特异性T细胞及其在同种T细胞识别和抗肿瘤实验研究中的应用-免疫学专业论文.docxVIP

目 录 一．中文摘要………………………………………………………………1-4 二．英文摘要………………………………………………………………5-9 三．正文 前言……………………………………………………………………10-11 第一部分：重组的抗原肽/MHC-I 复合物分子制备技术的建立 …………………………………………………………………………………12-43 第二部分：人工抗原呈递细胞制备技术的建立 …………………………………………………………………………………44-55 第三部分：用重组的抗原肽/MHC-I 复合物分子和 aAPCs 探索肽在 T 细胞同种识别机制中作用的研究 …………………………………………………………………………………56-68 第四部分：利用由人工抗原呈递细胞诱导肿瘤特异性同种 T 淋巴细 胞治疗肿瘤的研究 …………………………………………………………………………………69-77 四．小 结………………………………………………………………78 五．参考文献………………………………………………………………79-84 六．综 述………………………………………………………………85-94 七．附 录 附录1： 主要缩略词表 ………………………………………...95 附录2：攻读学位期间撰写的论文 ……………………………96 八．致 谢………………………………………………………………97 华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 1 PAGE 1 利用aAPC制备pMHC特异性T细胞及其在同种T细胞识别和抗肿瘤 实验研究中的应用 博士研究生 卢小玲 指导教师 吴雄文 教授 华中科技大学同济医学院免疫学系 摘 要 抗原特异性 T 细胞的活化是机体启动适应性免疫应答的关键事件。在此过程中， T 细胞的活化需要抗原呈递细胞（antigen-presenting cell，APC）提供的双信号，第一 信号由 APC 上的抗原肽/MHC 复合物（peptide/MHC, pMHC）和 T 细胞上的 T 细胞抗 原受体（TCR/CD3）结合提供, 该信号决定 T 细胞识别抗原的特异性；第二信号即共 刺激信号，由 APC 上的共刺激分子（B7、ICAM-1 和 LFA-3 等）与 T 细胞上的相应 受体（CD28、LFA-1、CD2 等）结合后产生，该信号为 T 细胞活化不可或缺的。TCR 以及其他 T 细胞表面分子和 APC 表面相应配体结合，通过介导信号转导事件和提高 T 细胞-APC 相互作用的总体亲和力而触发 T 细胞活化。T 细胞表面的 CD28 分子在功 能上是作为一个重要的共刺激受体，其结合 B7 分子或者抗 CD28 抗体后，可以提供 共刺激信号。据此，在细胞样大小（4-5um）的聚苯乙烯乳胶微粒上吸附 pMHC 和抗 CD28 抗体分子，使之成为能够为 T 细胞活化提供双信号的人工抗原呈递细胞（artificial antigen-presenting cell，aAPC）。显然 aAPC 表面呈递给 T 细胞的 pMHC 易于控制，克 服了传统抗原呈递细胞因表面 pMHC 分子复杂，而不利于制备抗原特异性 T 细胞的 缺点。因此，本研究在构建 aAPC 的基础上，将其用于同种 T 细胞识别的研究和肿瘤 实验治疗的研究。我们的研究结果表明同种 T 细胞是 pMHC 特异性的，根据同种 T 细胞具有 pMHC 特异性的特点，用 aAPC 制备单一 pMHC 特异性的同种 T 细胞，过 继治疗小鼠黑色素瘤，取得一定效果。本研究的主要内容及结果如下： 1. 重组的抗原肽/MHC-I 复合物分子制备技术的建立 背景：重组的抗原肽/MHC-I 复合物分子对构建人工抗原呈递细胞和研究 T 细胞 识别机制是十分有用的工具。 目的：构建一种有功能的HLA-A*2402/BRLF1198-206四聚体，同时建立一套可用于 制备各种重组的抗原肽/MHC-I复合物分子的制备技术。由于HLA-A*2402是亚洲人群 中最常见型别之一，我们选择HLA-A*2402分子与HLA-A*2402限制性的EB病毒抗原 肽 BRLF1198-206 来构建HLA-A*2402/BRLF1198-206四聚体。 方法：克隆 HLA-A*2402-BSP-pET21d 重组质粒，经 IPTG 诱导原核表达目的蛋 白，提取包涵体并初步纯化后溶于 8M 尿素中。在 HLA-A*2402 限制性的 EB 病毒抗 原肽 BRLF1198-206 存在条件下，将得到的 HLA-A*2402-BSP 融合蛋白和 β2m 进行稀释 复性折叠，形成折叠产物 HLA-A*2402/BRLF1198-206 复合物单体。