利用Uromodulin启动子及其3’端GPI锚定序列在肾小管上皮细胞中表达hEPO的分析：肾脏生物反应器-外科学(泌尿外科)专业论文.docxVIP

华中 科 技大 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10 利用 Uromodulin 启动子及其 3’端 GPI 锚 定序列在肾小管上皮细胞中表达 hEPO 的 研究：肾脏生物反应器 华中科技大学同济医学院协和医院泌尿外科 博 士 生 海 波 指导老师 李兵、肖传国 中文摘要 第一部分 hEPO 基因的克隆及其表达的研究 目的 克隆人促红 细胞生 成素（ hEPO）基因序列，构建 hEPO 基因的真核表 达载体 pcDNA3.1 hEPO 并在 Hela 细胞中表达 hEPO。 方法 采用逆转录及巢式 PCR 方法从人 肾组织中克隆 hEPO cDNA ，将 PCR 产物亚克隆到 pMD18 载体并测序。采用定点突变 技术纠正 PCR 过程中产生的碱基突变位点。利用脂质体转染Hela 细胞并用 Western blot 检测 hEPO 蛋白的表达情况。 结果 测序结果证实三个碱基突变位点得以纠正，得到 序列完全正确的 hEPO cDNA。脂质体成功转 染 Hela 细胞后 Western blotting 检测到 hEPO 蛋白的表达。 结论 成功构建了含 hEPO 基因的表达载体 pcDNA3.1 hEPO，并在 真核细胞中成功表达。 关键词： 逆转录 PCR，人促红细胞生成素，pcDNA3.1，定点突变，Hela 细胞 第二部分 Uromodulin 基因启动子表达特异性的研究 目的 比较Uromodulin基因启动子在多种不同真核细胞中表达的特异性及活性。方法 对含Uromodulin基因启动子的真核表 达质粒pEGFP-URO进行测序鉴定，利用脂质体 转染技术，将质粒转染人近端肾小管上皮细胞系（HK-2）、人肾癌细胞系（ ACHN）、 人膀胱癌细胞系（T24）、大鼠系膜细胞系（HBZY-1），用荧光显微镜和流式细胞仪观 察绿色荧光蛋白（GFP）表达的情况。经激发光照射后发出绿色荧光的为阳性 细胞， 并和pEGFP-N3进行对照研究。结果 转染24h后HK-2、ACHN阳性率较高（7-12/HP）， 流式检测结果为13.2%和11.4%；而T24、HBZY-1阳性率较低(0-1／HP)，流式检测结 果为0％和0．8％ 。pEGFP-N3在各组细胞中均有较高表达，其阳性率分别为23.08%(HK- 2)、19.24%(ACHN)、26.14%(T24)和18.03%(HBZY-1)。结论 小鼠Uromodulin基因启 动子在HK-2及ACHN中具有特异性的启动活性，其活性约为CMV的一半。 关键词 THP、Uromodulin、启动子、GFP、真核表达、组织特异性 第三部分 Uromodulin 基因 3’端 GPI 锚定序列的克隆及其在肾小管上 皮细胞中膜定位功能的研究 目的 克隆 Uromod ulin 基因 N’端 SP 序列和 C’端 GPI 锚定序列，利用 EGFP 在肾小管 上皮细胞中验 证其膜定位功能。 方法 采用逆转 录 PCR 方法从小鼠肾 组织中克隆 Uromod ulin cDNA 全长序列，利用巢式 PCR 克隆出 Uromod ulin 基因的 N’端 SP 序列 和 C’端 GPI 锚定序列。与报告基因 EGFP 构建真核表达质粒 pN3 SP-EGFP-GPI，转 染上皮细胞系 HK-2 后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达及膜定位情况。结果 成功获得 Uromod ulin 基因 C’端的 GPI 锚定序列，经测序与预 计序列一致。 pN3 SP- EGFP-GPI 转染 HK-2 细胞后在荧光显微镜下 观察到绿色荧光，其中大部分定位于细 胞膜。结论 利用 Uromod ulin 基因的 SP/GPI 序列能够将外源表达蛋白定位于上皮细 胞膜。 关键词 HK-2、Uromod ulin 、GPI 锚定蛋白、EGFP Expression of hEPO in Renal Tubular Cells Utilizing Uromodulin Promoter and 3’ GPI Anchor Gene: Kidney-Based Transgenic Bioreactor Abstract （一）Construction and Expression of Human Erythropoietin cDNA Expression Vector Objective: To generate a ma mma lian expression vector encoding the human erythropoiet in cDNA, and expressed in Hela cells. Met