利用凡纳滨对虾原代细胞培养体系筛选具有免疫增强活性中药的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

汕头大学硕士学位论文 汕头大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 摘 要 凡纳滨对虾(Penaeus Vanmamei)是目前我国重要的水产养殖品种，养殖产量占全国 对虾产量的 80% 以上。随着养殖规模和密度的增加，由水产病毒及病原菌诱发的对虾 疾病日益频发，造成了不可估量的经济损失。目前的普遍办法是利用抗生素，但抗生素 的广泛使用存在诱发病原菌耐药性、抗生素残留等问题。中药具有天然、高效、毒副作 用小、抗药性不显著以及资源丰富等优点，常被用作佐剂提升机体的防御能力。因此， 应用中药免疫增强剂有利于提升对虾免疫及抗病能力，及降低对虾的发病率及死亡率。 但是，中药有成千上万种，加上配伍更是不计其数。在这么多中药中筛选出有效的中药 是很困难的，因为目前还缺少高效的筛选系统。为此，本研究的目的旨在利用凡纳滨对 虾原代细胞，结合中药抑菌效果，建立一套能筛选免疫增强活性中药的系统，其优点在 于省时高效。 首先，测定了中药提取液对四种常见水产病原菌大肠杆菌(Escherichia coli, E. Coli)、 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus, Val)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)、嗜水气单 胞菌(Aeromonas hydrophila, Ah)的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度，评价了 30 种中药的抗 菌活性。结果表明，30 种中药提取液中 12 种具有抗菌活性，抑菌活性具有广谱性；其 中丁香、山萸肉、五味子、罗汉果和八角 5 种具有较强抑菌作用。 第二，成功优化了凡纳滨对虾肝胰脏细胞最佳培养条件：最适培养基为 2×L-15， 最适 pH 为 7.6，添加 1.2% NaCl、5 %小牛血清、1000 IU/mL 青霉素以及 1000 ?g/mL 链 霉素，28℃下在 5% CO2 培养箱中培养。血淋巴细胞的最佳培养条件：最适抗凝剂为 27 mM 柠 檬 酸 钠 +337 mM NaCl+115 mM Glucose+9 mM EDTA·Na2 ， 最 适 培 养 基 为 DMEM，28℃下在 5% CO2 培养箱中培养。 第三，基于所建立的凡纳滨对虾血淋巴和肝胰脏原代细胞培养体系，本文通过测定 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)、碱性 磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、酚氧化酶原(Prophenoloxidase, proPO)、谷胱甘肽- 过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)活性，丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、超 氧阴离子(Superoxide, O2-)水平以及细胞存活率，评价了 30 种中药提取液对体外细胞的 细胞毒性及免疫增强作用。结果表明，黄连、五味子等提取液等可以激活 proPO 免疫体 I 系，proPO、AKP、GSH-Px、SOD 活性及 O2-水平呈现不同程度的提升，但 ACP 活性无 明显变化；然而过量的中药提取物会降低细胞存活率，造成脂质过氧化等细胞氧化损伤。 最后，基于以上免疫因子的活性数据以及灰色关联度的多目标决策模型，对 30 种 中药的免疫调节能力进行综合评价，结果显示其中 12 种中药的综合评价值高于对照组， 分别为丁香、五味子、黄芩、八角、山萸肉、紫苏叶、青蒿、豆蔻、黄连、升麻、大黄 和泽泻。所筛选出的中药是对凡纳滨对虾具有免疫增强潜力的备选中药，可进一步开发 利用。 综上所述，本研究不仅探究了 30 种中药提取物对常见水产病原菌的抗菌作用；而 且建立了凡纳滨对虾的血淋巴和肝胰脏细胞的原代培养体系，并且应用于对其细胞毒性 和免疫调节能力的评价，并在体外成功筛选出了低细胞毒性、高免疫增强活力和抗菌能 力的中药免疫增强剂。这样就初步建立了一套能筛选免疫增强活性中药的系统，并在细 胞层次上实现了对 30 种中药的筛选。 关键词：凡纳滨对虾; 体外; 原代细胞; 中药; 筛选; 免疫增强; 抗菌 II Abstract Penaeus vannamei is an important aquaculture species in our country at present, and its yield account for more than 80% of Chinese penaeid shrimps consumption. With the increase of the scale and density of aquaculture, the shrimp industry has often suffered incalculable economic