利用RNAi技术鉴定SRBSDV在白背飞虱体内增殖的关键因子-植物保护专业论文.docxVIP

利用RNAi技术鉴定SRBSDV在白背飞虱体内增殖的关键因子-植物保护专业论文.docx

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本人声明,所呈交的学位(毕业)论文,是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果,并且是自己撰写的。尽我所知,除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外,论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志,都在论文中作了明确的说明并表示了谢意,如被查有侵犯 他人知识产权的行为,由本人承担应有的责任。 学位(毕业)论文作者亲笔签名: 日期: 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定,即学 校有权送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅; 学校可以公布论文的全部或 部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密,在 年后解密可适用本授权书。 □ 不保密,本论文属于不保密。 □ 学位(毕业)论文作者亲笔签名: 日期: 指导教师亲笔签名: 日期: i i 目录 摘 要 I 1 引言1 1.1 南方水稻黑条矮缩病毒的研究进展 1 1.1.1 南方水稻黑条矮缩病的发现、分布以及危害 1 1.1.2 南方水稻黑条矮缩病的表型症状特点 1 1.1.3 南方水稻黑条矮缩病的自然寄主和传播介体 2 1.1.4 SRBSDV 的病毒学分类地位 3 1.1.5 SRBSDV 的基因组结构及其功能研究 4 1.2 植物呼肠孤病毒复制场所—病毒原质的研究进展 6 1.3 植物病毒在介体昆虫体内的侵染循回过程 7 1.4 原核表达系统的研究概况以及应用 8 1.5 RNAi 的发现以及应用 9 RNAi 的发现 9 RNAi 的原理 10 RNAi 技术应用 10 1.6 本研究的目的和意义 11 2 实验材料和方法12 2.1 实验材料12 2.1.1 菌株和载体12 2.1.2 水稻病株和介体昆虫白背飞虱 12 2.1.3 实验试剂12 2.1.4 实验主要器材13 2.2 实验方法13 2.2.1 SRBSDV 蛋白 P5-1 抗体的制备 13 引物的设计和合成13 感染 SRBSDV 的水稻总 RNA 提取 13 RT-PCR 扩增 SRBSDV 的基因片段 P5-1 14 纯化回收扩增的 SRBSDV P5-1 产物 15 入门载体 pDONR221-P5-1 的构建 16 原核表达载体 pDEST17-P5-1 的构建 18 原核表达载体 pDEST17-P5-1 转入 Rosetta(DE3)菌株 18 SRBSDV 非结构蛋白 P5-1 抗血清的制备 19 0 P5-1 抗血清的特异性检测 19 1 P5-1 抗血清的纯化 20 2 抗体交联荧光素21 3 P5-1 在 SRBSDV 侵染的白背飞虱体内的分布 21 2.2.2 源于 SRBSDV 基因片段的 dsRNAs 对病毒侵染白背飞虱的影响 22 dsRNA 的引物设计和合成 22 微针注射体外合成的 dsRNA 23 免疫荧光标记检测 dsRNAs 处理对 SRBSDV 在白背飞虱体内侵染的影 响 23 RT-qPCR 检测体 dsRNAs 处理对 SRBSDV 侵染白背飞虱的影响 23 ii ii Western blot 检测 dsRNAs 处理后 SRBSDV 编码的相关蛋白在白背飞虱 体内表达量的变化 23 3. 结果分析24 3.1 SRBSDV 非结构蛋白 P5-1 抗体的制备 24 3.1.1 RT-PCR 扩增目的片段 24 3.1.2 入门载体 pDONR221-P5-1 的构建 25 3.1.3 原核表达载体 pDEST17-P5-1 的构建 26 3.1.4 原核表达载体 pDEST17-P5-1 转入 Rosetta(DE3)菌株 26 3.1.5 SRBSDV 非结构蛋白 P5-1 的原核诱导表达 27 3.1.6 Western blot 检测抗血清的特异性 28 3.1.7 P5-1 在 SRBSDV 侵染的白背飞虱体内的分布 28 3.2 dsRNAs 处理对 SRBSDV 侵染白背飞虱的影响 29 3.2.1 dsRNA 的合成 29 3.2.2 dsP5-1 处理对病毒相关基因在白背飞虱体内的表达的影响 29 3.2.3 dsP6 处理对病毒相关基因在白背飞虱体内的表达的影响 32 3.2.4 dsP9-1 处理对病毒相关基因在白背飞虱体内的表达的影响 35 3.3 干扰单个基因表达明显抑制病毒在白背飞虱体内的复制 38 3.4 dsRNA 处理抑制 SRBSDV 相关基因在蛋白

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