雷竹PvPin1At基因克隆和功能分析-森林培育专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 独 创 性 声 明 本人声明，所呈交的学位论文，是在指导教师指导下，通过我的努力取得的成果，并且是自 己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已经作了答谢的地方外，论文中不包含其 他人发表或撰写过的研究成果，也不包含在浙江农林大学或其他教育机构获得学位或证书而 使用过的材料。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢 意。如被查有严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位论文作者亲笔签名： 日 期： 论文使用授权的说明 本人完全了解浙江农林大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印件， 允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他 复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。□ 不保密, 本学位论文属于不保密。 □ （请在方框内打“√”） 学位论文作者亲笔签名： 日 期： 指导教师亲笔签名： 日 期： 摘要 摘要 万方数据 万方数据 摘要 Pin1（peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，PPIase）是肽基脯氨酰顺反异构酶。Pin1 对植物成花转变和人类癌症等疾病具有调控作用。在对拟南芥 Pin1 同源基因 Pin1At 研究中发现，Pin1At 基因具有调控开花时间的作用。拟南芥中 Pin1At 蛋 白 是 通 过 促 进 SOC1 和 AGL24 两个 MADS-domain 转 录 因 子 中 磷 酸 化 的 Ser/Thr-Pro 基团顺反异构来调控成花转变，从而调控植物开花时间。本实验希望 通过对雷竹（Phyllostachys violascens）Pin1At 同源基因的克隆和功能分析，进一 步了解竹类植物开花机理，为竹类植物开花研究奠定理论和实践基础。 实验根据玉米、水稻、以及雷竹转录组数据库设计引物，以雷竹（Phyllostachys violascens）为材料，利用 cDNA 末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)，获得 PvPin1At cDNA 全长 756bp 序列。用高保真酶扩增雷竹 PvPin1At ORF 区，得到 2 条 PvPin1At 序列，命名为 PvPin1At1 和 PvPin1At2，它 们的开放阅读框都为 369bp，编码 122 个氨基酸。其中，PvPin1At1 第 59 个氨基 酸为丝氨酸，PvPin1At2 在第 59 个氨基酸为甘氨酸。对 PvPin1At 基因分析和研 究，得出以下结果： （1）通过序列比对发现 PvPin1At 基因在植物中相当保守，系统进化树分析 表明 PvPin1At 基因与禾本科植物二穗短柄草、水稻等聚为一类。 （2）对处在开花期雷竹做荧光定量 PCR 分析，发现该基因在嫩叶中表达量 最高，其次是茎和鞭，在花芽、老叶、笋中表达量低。对不同时期的雷竹（开花 前四周到开花），做荧光定量 PCR 分析，发现 PvPin1At 基因在开花前表达量逐 渐升高，当达到一定阈值后表达量逐渐下降。 （3）通过酵母双杂交实验，证明雷竹中 PvPin1At 蛋白与 PvSOC1 蛋白不能 相互作用。 （4）PvPin1At 基因转入拟南芥功能验证发现，35S::PvPin1At1 转基因拟南 芥比野生型拟南芥早开花 6-7d，而 35S::PvPin1At2 转基因拟南芥与野生型拟南芥 表型差异不明显，说明 PvPin1At1 基因中的第 59 位丝氨酸可能对雷竹开花调控 有重要作用。 I （5）为了研究 PvPin1At 蛋白的晶体结构，我们构建了原核表达载体，获得 可溶目的大小为 31kDa 左右的 PvPin1At 蛋白。 （6）因为人类 Pin1 基因的第 71 号丝氨酸突变为天冬氨酸后，会造成功能 缺失，所以我们对雷竹 PvPin1At 相应位点的 27 位丝氨酸突变为天冬氨酸，构建 了该位点突变的植物双元表达载体，通过转入拟南芥突变体，证明其功能是否有 缺失。 （7）PvPin1At1 转入水稻中，目前已获得 T1 代水稻 40 株，通过 DNA 检测 证明 PvPin1At1 已经成功转入水稻中。 关键词：PvPin1At，开花时间，同源克隆，雷竹。 II AB ABSTRACT ABSTRACT Pin1（peptidyl-prolyl cis/trans isomerase, PPIase）encodes peptide-prolyl cis-trans isomerase. In the study of Arabidopsis, Pin1At regulated flowering time and floral t