硫化氢对小鼠阻塞性肾损伤的保护作用-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

HYDROGEN SULFIDE AMELIORATES OBSTRUCTIVE KIDNEY INJURY A Dissertation Submitted to the Graduate School of Henan University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science By Huijun Cheng Supervisor: Yanzhang Li Date April, 2015 I I PAGE PAGE IV 摘 要 背景 硫化氢（hydrogen sulfide）是在哺乳动物体内发现的继一氧化碳和一氧化氮之后的 又一种新型气体信号分子，硫化氢可以在哺乳动物的很多组织和器官中被检测到表达， 参与了生物体内各种的生理和病理活动并发挥着重要作用。最近的很多研究表明，硫化 氢与多种阻塞性疾病有关，并且也有实验验证了硫化氢对肾脏纤维化具有保护作用。然 而，硫化氢在肾脏纤维化中发挥的作用的具体的作用机制还不是很清楚和明确。慢性肾 病是一种影响广泛的疾病，其主要的特点是肾小球滤过率逐步降低，最终会导致肾功能 的衰竭。肾小管间质纤维化是影响慢性肾病的最为主要决定性的因素，发生的主要原因 是细胞外基质的积聚以及肾间质肌成纤维细胞的增殖等缘故。单侧输尿管结扎模型 （UUO）是梗阻性肾病肾小管间质纤维化的一个典型的模型，这个模型再现了阻塞性肾 病最具代表性的特征，包括细胞渗透，肾小管细胞增殖和凋亡，以及上皮间质转化(EMT)， 成纤维化积累，细胞外基质(ECM)的沉积，以及肾小管萎缩等，并且这个疾病模型已应 用于多个研究以评估在这些过程中所涉及的机制。由于 UUO 模型可以引起肾脏输尿管 的完全梗阻，但是肾脏输尿管完全阻塞是很少发现在人类身上的，所以这是 UUO 模型 的一个不足之处，但它的优点是可以快速地形成阻塞性肾病。 自噬是一个细胞吞噬自身胞质内的蛋白质等分子或者细胞器并使其包裹进入囊泡， 然后囊泡再与溶酶体进行融合，再利用溶酶体内的酶类复合物来降解其内部所包裹的内 容物的过程，自噬可以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。有研究表明自噬 在肾脏纤维化过程中起着重要的作用。 目的 探讨硫化氢在小鼠单侧输尿管结扎手术所引起的肾纤维化过程中的具体的保护作 用，以及硫化氢在肾纤维化过程中可能的机制。 方法 将 8 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠随机分为假手术组（n=5）,实验组（n=5）和 H2S 处 理的实验组（n=5）。在无菌条件下将实验组和硫化氢组小鼠左侧输尿管进行结扎处理， 假手术组打开左侧肾脏外皮肤和肌肉，寻找到肾脏后即进行缝合。H2S 组小鼠腹腔注射 H2S 供体硫氢化钠（NaHS），剂量为 50μmol/次/天，对照组小鼠和假手术组小鼠注射 等体积的生理盐水，每天一次。给药 7 天，建模后第 7 天经腹腔注射过量 2%戊巴比妥 钠麻醉剂处死小鼠。取出肾脏，从中间切开，一半用于切片做组织观察，一半用于提取 蛋白和 RNA。通过组织 HE 染色，观察实验组和硫化氢组和假手术组三组小鼠肾脏的组 织结构有无差别，使用 Masson 染色方法，检测其胶原蛋白。核酸凝胶电泳检测 CBS， CSE，3-MST 等产生硫化氢气体的酶的 RNA 的表达情况；蛋白电泳检测 LC3 和 Beclin-1 的表达情况，评估其自噬水平；蛋白电泳检测肾脏 fibronectin 的表达情况，评估其纤维 化程度。 结果 1. 产硫化氢的酶 CBS，CSE 和 3-MST 的 RNA 表达量在手术后降低。 2. UUO 小鼠肾脏的胶原纤维染色比硫化氢处理组要多，且 UUO 小鼠肾脏纤维比假 手术组要多。 3. 与假手术组小鼠相比，实验组小鼠肾脏中 FN 的蛋白表达增高很多；而硫化氢组 小鼠的 FN 表达量比实验组小鼠的 FN 表达量要少。 4. 与假手术组小鼠相比，实验组小鼠肾脏中 LC3-II 蛋白和 Beclin-1 蛋白的表达增 高很多；而硫化氢组小鼠的 LC3-II 和 Beclin-1 蛋白表达量比实验组小鼠的 LC3-II 表达 量要多。 结论 在小鼠肾脏输尿管结扎手术之后，小鼠的自噬水平相比之前增加很多，而硫化氢提 高了肾脏细胞的自噬水平；输尿管结扎手术后小鼠的肾脏发生纤维化，硫化氢减轻了纤 维化水平；硫化氢可能通过自噬减轻输尿管结扎所引起的纤维化。 关键词： 小鼠；UUO；硫化氢；纤维化；自噬。 III III PAGE PAGE IV ABSTRACTS Backgound Hydrogen sulfide is found to be the third gaseous signal m