磷酸化修饰对HSF4b转录活性的调控-基础医学专业论文.docxVIP

I I PAGE PAGE VI 摘 要 背 景 白内障是由于眼球晶状体的部分或全部浑浊化所导致的视力下降。可分为早发型 （先天性）白内障和遗传性白内障。先天性白内障是指出生后一年内出现的晶状体浑浊， 是儿童视力丧失的主要原因之一。先天性白内障的遗传方式有常染色体显性遗传、常染 色体隐性遗传和X连锁隐性遗传等，其中以常染色体显性遗传性先天性白内障（ADCC） 为主。 到目前为止，通过对一系列ADCC家族进行基因连锁分析，对先天性白内障的遗传 背景有了更加详细的了解，约有40多个遗传位点和常染色体显性先天性白内障有关，按 照其编码蛋白功能，与人类ADCC有关的基因分一下四类：晶状体蛋白基因，转录调节 因子基因，细胞骨架蛋白基因和膜转运蛋白基因。其中转录调节因子基因中的HSF4有 很重要的作用，对其研究亦有所进步，它在晶状体纤维细胞的生长和成熟等过程中起着 重要作用，但是其转录调控的机制还不清楚。近年来发现与白内障有关的突变位点的数 量已超过100个。在人体内，通过对一系列ADCC家族进行基因连锁分析发现均存在HSF4b 基因的错义突变。在小鼠，通过转基因技术敲除小鼠的HSF4基因，新生小鼠出生后3-5 天即出现白内障，可能与晶状体纤维细胞分化和发育异常有关。 HSF4是HSFs即热休克转录因子家族的一个成员，它在外界和内环境等的刺激或者正 常生理状态下都可形成三聚体，然后和热休克元件（HSE）结合，激活下游HSP27、HSP70、 HSP90以及晶状体蛋白等的表达。HSF4分两不同亚型：HSF4a和HSF4b。前者有转录抑 制活性，而后者具有转录激活和抑制双重作用。HSF4b是晶状体内特异表达的亚型。 小 鼠晶状体HSF4b的缺失降低Hsp25，γ-crystallin和CP49等蛋白的表达。 磷酸化是蛋白质最重要的翻译后修饰之一，在细胞信号的传递过程中占有极其重要 的地位，HSF4b 在生理条件下即可处于磷酸化状态，也可以受 MAP 激酶调控发生磷酸 化修饰，即 HSF4b 受 P38、JNK 和 ERKl/2 的磷酸化调控发生磷酸化，磷酸化后激活其 下游热休克蛋白表达，磷酸化可诱导 HSF4b 类泛素化，SUM0 反过来抑制了 HSF4b 体 外转录活性。HSF4 中含有一个 PDSM（磷酸化依赖 SUMO 化修饰基序）模体，PDSM 存 在于保守两个功能不同的热休克因子家族成员 HSF1 和 HSF4b 中间，与 SUMO 相似， PDSM 通过磷酸化依赖 SUMO 化，发过来抑制了底物的转录活性。HSF4b 中的 S299 丝 氨酸处于 PDSM 模体 PASP 中，因此我们推测该位点磷酸化后能反过来抑制 HSF4b 的转 录活性。 14-3-3 与靶蛋白结合时主要通过识别靶蛋白中的磷酸化丝氨酸/苏氨酸识别序列。 根据这些序列模体可以推测某些蛋白质能否和 14-3-3 蛋白结合，S299 位点存在含有丝 氨酸的模体，我们猜测它是否与 14-3-3 相互作用。下一步实验既是利用三个突变体分 别与 14-3-3 共转染观察它们的结合作用，结合下游蛋白的表达量来分析该位点磷酸化 后对 HSF4b 的转录活性调节。 为了进一步了解控制 HSF4b 转录活性的分子机制，我们就磷酸化调控 HSF4b 的机 制进行探讨，预测可能的蛋白序列磷酸化位点,将其定点突变进行功能研究和机制研究， 找到相应的磷酸化激酶和通路。 本实验通过构建HSF4b的突变体，测定HSF4b的转录活性，确定有效的磷酸化位点以 及对下游相关基因的调控。 目 的 本研究通过构建HSF4b的突变体，测定HSF4b的转录活性，确定有效的磷酸化位点以 及HSF4b下游相关基因的调控。 方 法 1. 应用 PCR 技术，利用突变引物扩增 PWZL-blast-HSF4b(以下简称 HSF4b)，产物用 DpnⅠ酶切，转化至 DH5α 中，提取质粒，ECORⅠ初步酶切鉴定，测序。 2. 测序证确后，将上述突变质粒转染 293T 细胞，进行真核表达。利用 SDS和 Western blot 实验鉴定 HSF4b 和 Hsp27 蛋白的表达，初步确定有效的磷酸化位点。 3. 利用 HSF4b 缺失的晶状体上皮细胞（MLEC -/-），转染突变体质粒，建立稳定株 MLEC HSF4b、MLEC HSF4b/ S299A、MLEC HSF4b/ S299D 和 MLEC HSF4b/ S299E。 Western blot 实验鉴定 HSF4b 和 Hsp27，alpha B-crystallin 等蛋白的表达。 4. 通过 luciferase assay 实验，来验证 HSF4b/S299A,HSF4b/S299D, HSF4b/S299E 对下 游基因 α B- 晶体蛋