颗粒裂解肽G13结构域的克隆表达和蛋白质结构比对-细胞生物学专业论文.docxVIP

I I 摘 要 抗菌肽是由 6－100 个氨基酸组成的有杀菌作用的小肽，至今尚未发现细菌对 其有抗药性，因此有极大的应用价值。目前药物多肽主要通过化学合成和基因工 程生产，其中基因工程方法获得的成本较低,同时也为设计更利于临床应用的抗菌 肽提供实验依据。基于抗菌肽数据库，利用序列和结构比对方法，可以为设计产 生新的有较强活性的抗菌肽打下理论基础。 颗粒裂解肽 Granulysin 是由两个二硫键连接五个螺旋片段组成的抗菌肽，存 在于细胞毒性淋巴细胞 CTL 和天然杀伤细胞 NK 内的颗粒中，具有广谱抗菌活 性；其 G13 结构域是由 19 个氨基酸残基组成的一个 α 螺旋和 loop 结构，对颗粒 裂解肽的活性较为重要，可抑制细菌、真菌的活性，但对动物细胞和脂质体没有 影响，因此具有重要的理论和应用研究价值。本实验室在前期研究中构建表达了 颗粒裂解肽 G13 结构域，但表达量只为 3%；本文为了提高蛋白表达量，在宿主 菌大肠杆菌 Top10 中改用融合表达，根据大肠杆菌表达偏好密码子，将 G13 结构 域多肽序列反翻译为核酸序列；采用化学合成核酸序列，PCR 扩增后的产物用 T-A 克隆法与 pBAD/TOPO ThioFusion 表达载体连接，转化“感受态”大肠杆菌 Top10， 构建基因工程菌，对目的蛋白进行表达；用 SDS检测表达结果表明表达量 达到 67%，这为探索一种新的低成本生产抗菌肽的方法提供了参考。 应用 PredictProtein 预测方法（ ）对表达的蛋白质序列 (QRSVSNAATRVCRTGRSRW)进行二级结构特征分析，发现目的蛋白序列在融合 蛋白中原有的 α 螺旋活性结构没有改变，目的蛋白仍然保持原有的活性结构。这 进一步说明用基因工程的方法得到高产量的抗菌肽切实可行。 根据已发现的大量抗菌肽的分子结构，通过分析比较抗菌肽分子的蛋白质一 级结构和空间构象的关系，可以设计具有高活性的新型抗菌肽分子序列。为了从 抗菌肽的数据库中尽快找到活性强的抗菌肽，需要较快的蛋白质结构比对算法。 本文提出了新的基于三维结构不变量（如主链连续四个碳原子的体积）的蛋白质 结构比对算法。通过将三维结构数据转换为数值的比较得到最优的两序列比对， 这极大地降低计算量。与一些著名的结构比对软件（如 Dali, STRUCTAL, CE 和 II II SSM 等）的仿真比较，本文的算法较好地权衡了“均方根偏差”（RMSD）和“匹配 的残基个数”这两个互相矛盾的比对评价标准。 关键词：抗菌肽 基因工程 颗粒裂解肽 G13 结构域 蛋白质结构 PAGE PAGE IV Abstract Antimicrobial peptides are relatively small (consisting of 6 to 100 aminoacids) amphipathic molecules with activity against a wide range of microorganisms. New kinds of antibacterial peptides can be designed by bioinformatics and expressed in Escherichia coli by genetic engineering techniques, The processions will down cost of production and provide technical data for design and could expresse higher activity antibacterial peptide in future. Granulysin, a 9-kDa bactericidal protein existing in human cytotoxic T cells, disrupts lipid membranes and induces apoptosis in mammalian cells. The crystal structure of granulysin is combined of five helical segments joined by two disulfide linkages. Granulysin has the potent cell lytic activity against both Gram-positive and Gramnegative bacteria, fungi, parasites and tumor cells, including Mycobacterium tuberculosis and Mycobact