硫嘌呤类药物安全性监测体系的建立-药剂学专业论文.docxVIP

山西医科大学 山西医科大学硕士学位论文 硫嘌呤类药物安全性监测体系的建立 摘要 抗代谢药：硫鸟嘌呤(6-thioguanine, 6-TG)，6-巯基嘌呤（6-mercaptopurine, 6-MP)及硫 唑嘌呤(Azathioprine, AZA)均为嘌呤拮抗剂，这类药物通过干扰嘌呤代谢的所有环节，抑制 嘌呤核苷酸的合成，进而抑制细胞 DNA、RNA 及蛋白质的合成。在临床上，硫嘌呤类药 物除用于治疗急性白血病外，主要作为免疫抑制剂广泛用于器官移植以及自身免疫疾病的 治疗。但是此类药物的治疗存在很大的个体差异。药物个体疗效的不确定性和对于药物严 重毒副作用的顾虑都限制了硫嘌呤类药物在患者中的使用，主要原因是临床缺乏相应的预 测方法，这一矛盾在国内尤为突出。 目前，临床上通过定期监测服用硫嘌呤类药物患者的血象来指导其合理用药。研究发 现药物活性物质的水平和降低的红细胞计数、降低的血小板计数、降低的白细胞计数、降 低的中性粒细胞计数呈正相关[1]。因此定期进行常规的血细胞计数有助于诊断此类药物的 血液毒性，但是常规的血象监测难以预测毒性的危险性，通常在血细胞计数发生改变之前, 骨髓已受到一定损害，在血常规改变之后，骨髓的造血功能已受严重影响，血中药物活性 物质浓度已高出正常治疗浓度[2]，导致硫嘌呤类药物不良反应增多，甚至造成严重的医疗 事故。 众多研究表明，硫嘌呤类药物治疗的个体差异与其代谢途径密不可分。这类药物本身 均无生物活性，必须经过体内一系列的酶代谢途径，最终生成有活性的 6-硫代鸟嘌呤核苷 酸(6-thioguanine nucleotides, 6-TGNs)产生细胞毒效应而发挥疗效，但其亦是骨髓抑制的主 要原因。6-TGNs 在体内的浓度决定了此类药物的有效性和毒性。而巯嘌呤甲基转移酶 (thiopurine methyltransferase, TPMT)作为硫嘌呤类药物代谢途径中重要的代谢酶，竞争性抑 制 6-TGNs 的生成，进而影响药物的疗效及毒副作用。临床研究表明，TPMT 活性在不同 个体之间有很大的差异。如果患者 TPMT 活性较低或遗传有 TPMT 缺陷, 即使给予常规剂 量的药物，也会生成过多有活性的 6-TGNs, 大大增加了骨髓抑制的风险[3,4]，另一方面， 具有 TPMT 高活性的患者，在常规剂量下却很难达到治疗效果，而且过多的甲基化产物的 生成可能导致肝脏毒性的发生[5,6]。 TPMT 基因多态性是造成 TPMT 酶活性个体差异的主要原因，目前对于中国汉族健康 人群的 TPMT 活性分布及基因多态性分布情况已见报道，汉族健康人群的 TPMT 活性呈正 态分布，且 TPMT*3C 为最主要的突变等位基因[7]。TPMT 基因突变导致 TPMT 活性降低[8]， I TPMT 野生纯合子对应 TPMT 高活性，TPMT*3C 突变基因杂合个体显示 TPMT 中等活性， 而突变纯合子对应 TPMT 活性缺乏。鉴于以上情况，本研究对收集的 114 例自身免疫疾病 患者进行了 TPMT*3C 的筛选和 TPMT 酶活性的检测，以期建立硫嘌呤类药物安全性监测 体系，为临床提供个体化用药依据。 1. 建立引物特异性 TaqMan 聚合酶链反应检测 TPMT*3C 突变 1.1 标本来源 114 例自身免疫疾病患者，包括 39 例类风湿性关节炎，33 例白塞综合症，22 例干燥综 合症，20 例间质性肺炎。所入选的患者均为汉族人，性别、身高、体重不限，年龄范围 3—68， 性别男性 87 例，女性 27 例。以直接调查方式获得相关资料，包括：年龄、性别、体重、 民族、合并药物以及不良反应等。 方法 参照OMEGA公司的SE Blood DNA Kit试剂盒说明书从患者全血标本中提取基因组 DNA。应用引物特异性TaqMan 聚合酶链反应（PS-TaqMan PCR）检测114例临床标本的 TPMT*3C突变。每个模板DNA分别用野生型引物探针对及突变型引物探针对检测，野生 型引物探针对反应管标为A管，Ct值记作CtA, 突变型引物探针对反应管标为B管Ct值记作 CtB，CtA与CtB的差值记作△Ct。 为保证PS-TaqMan PCR检测结果的准确性和重复性。①每次检测均设野生型和突变型 质控模板，质控模板为经过分型验证的接近检测浓度下限的DNA，两种质控模板均需正确 分型；②每一样本均用野生型和突变型两套引物探针检测，△Ct需大于6或小于3，并且其 中一个Ct值需小于30。前者是防止非特异性扩增对结果判断的干扰，后者是杜绝由于标本 中模板量不足或其他因素造成扩增体系效率不高而带来的结果误判。 此法主要利用 DNA 聚合酶扩增过程中的保真性原理，适当人为扩大引物与模板结合 时的错配比例