修改版免疫学创新性实验香菇多糖对正常小鼠及免疫抑制小鼠免疫功能的影响.ppt

香菇多糖对正常小鼠及免疫抑制小鼠免疫功能的影响 实验背景 香菇多糖是从优质香菇子实体中提取的有效活性成分，其中的活性成分是具有分支的β— (1—3)—D—葡聚糖，主链由β—(1—3)—连接的葡萄糖基组成，沿主链随机分布着由β—(1—6)连接的葡萄糖基，呈梳状结构。 实验背景 香菇多糖的作用类似一种宿主免疫增强剂, 能够通过刺激关键细胞的成熟、分化和增殖, 通过改善宿主机体平衡达到或提高宿主细胞对淋巴因子、激素及其它生物活性因子的反应性作用。香菇多糖具有多种生物学和免疫学活性, 除了具有抗肿瘤作用外, 还可提高机体对多种细菌、寄生虫、病毒性感染(包括艾滋病)的抵抗力。 研究进展 T 淋巴细胞——T 细胞导向并有巨噬细胞参与的免疫佐剂（抗肿瘤主要机制）。 B 淋巴细胞——动物实验中有促进β 淋巴细胞合成IgG 、IgM 的能力, 并能提高免疫低下者IgA 、C3 水平, 使脾抗体分泌细胞数目及特异性花结形成细胞数目增多。 巨噬细胞——增强巨噬细胞对MAF（巨噬细胞活化因子） 的反应性, 尤其在免疫功能抑制的荷瘤小鼠的实验中更为显著。 NK——体内能使脾脏和腹腔的NK 细胞活性增强, 且与剂量相关。 血管内皮——激活内皮系统, 可使炎性细胞、免疫活性细胞浸透到肿瘤组织中, 并增强肿瘤基质的网状纤维的产生,是发挥抗肿瘤作用特点之一。 实验意义 研究发现中药香菇多糖能明显增强机体免疫功能。 通过此次研究探究香菇多糖对正常小鼠与免疫抑制小鼠免疫功能（包括固有免疫和适应性免疫应答等）的影响。 实验思路 整体思路：分别检测在3 个不同剂量下香菇多糖对正常小鼠以及免疫抑制小鼠免疫功能的影响。 观察指标：巨噬细胞吞噬功能、小鼠脾脏NK细胞活性测定、B淋巴细胞增殖能力、DTH(迟发型超敏反应)小鼠耳后淋巴结和小肠派氏结中T 淋巴细胞活性、血清中 IL-2、IL-6、TNF、IL-10含量等指标的影响。 待改 复合造模法：放射源照射后腹腔注射环磷酰胺和氯霉素 巨噬细胞吞噬功能测定 腹腔注射鸡红细胞后吸取腹腔液测定吞值百分率和吞噬系数 收集脾细胞制成细胞悬液，酶联免疫检测仪上测定OD值 分离制备B淋巴细胞后用MTT法检验增殖率 通过流式细胞术在流式细胞仪上测定DTH小鼠耳后淋巴结和小肠派氏结中信号强度。 用ELISA法测定血清中IL-2，IL-6的含量 主要技术路线 免疫抑制小鼠模型 NK细胞活性测定 B淋巴细胞增殖能力 T 淋巴细胞活性测定 IL-2，IL-6含量的测定 材料 药物与试剂香菇多糖，环磷酰胺，氯霉素，鸡红细胞，1640培养液，二甲基亚砜，Hank’s液，5 %DNFB 丙酮，冷PBS，流式抗体PE-Cy7-anti-mouse CD ，FITC-antimouseB220， PE-anti-mouse CD25，FITC-antimouseCD69 仪器 显微镜，酶联免疫检测仪，流式细胞仪，CO2培养箱，ELISA试剂盒 动物 Balb/c 小鼠[9]200只，体重18 ～ 22 g ， 雌雄各半，由浙江大学医学院动物中心提供。 实验分组 香菇多糖高剂量组 正常小鼠 空白对照组 香菇多糖中剂量组 香菇多糖低剂量组 再随机分成a1，a2，a3，a4，a5，共5组 再随机分成d1，d2，d3，d4，d5，共5组 再随机分成b1，b2，b3，b4，b5，共5组 再随机分成c1，c2，c3，c4，c5，共5组 实验分组 香菇多糖高剂量组 免疫抑制小鼠 空白对照组 香菇多糖中剂量组 香菇多糖低剂量组 再随机分成e1，e2，e3，e4，e5，共5组 再随机分成h1，h2，h3，h4，h5，共5组 再随机分成f1，f2，f3，f4，f5，共5组 再随机分成g1，g2，g3，g4，g5，共5组 实验分组 a1,b1,c1,d1,e1,f1,g1,h1组小鼠 给药后 腹腔巨噬细胞吞噬功能测定 DTH小鼠耳后淋巴结和小肠派氏结中T 淋巴细胞活性测定 脾脏NK细胞活性测定测定 B细胞增殖能力测定 a2,b2,c2,d2,e2,f2,g2,h2组小鼠 a3,b3,c3,d3,e3,f3,g3,h3组小鼠 a4,b4,c4,d4,e4,f4,g4,h4组小鼠 a5,b5,c5,d5,e5,f5,g5,h5组小鼠 血清中IL-2，IL-6含量检测 腹腔注射给药 香菇多糖 (1 )香菇多糖高剂量组(10mg /kg?d , 0.2 mL/ d); (2)香菇多糖中剂量组(5mg/ kg?d , 0.2mL /d); (3)香菇多糖低剂量组(1mg/ kg?d , 0.2mL /d); 生理盐水（空白对照组） 方法及剂量同上，但药物为生理盐水 腹腔巨噬细胞吞噬功能测定实验[1] 腹腔注射鸡红