液相色谱的分离机理及色谱柱.pptVIP

液相色谱的分离机理及色谱柱 选HPLC参数时的基本考虑 溶解度 - 选择流动相的条件 分子量 - 在样品预处理或GPC分析时有用 样品的基质 - 考虑如何前处理 在基质中样品的含量 检测特性 - 有否紫外吸收? 荧光? 找出样品中不同组份之间的差异 摸索条件的重要线索 极性问题 液相色谱的分离机理 正相 反相 体积排除 离子交换 其他 不同的分离模式是不同的机理 吸附色谱的分离机理 吸附色谱概述 分离基于样品的极性差异。 洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱 常用的流动相∶ 非极性有机溶剂，如己烷 乙酸等为添加剂 常用固定相∶ 硅胶、氧化铝等。 分配色谱的分离机理 分配色谱概述 反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离 洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱 常用的流动相： 有机溶剂如甲醇、乙腈，水 应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法 常用固定相： 碳十八、碳八、胺基等基团 反相色谱固定相多为键合相? 键合相色谱柱 以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。 优点∶ 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点∶ pH值不能小于3 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同 体积排除色谱的分离机理 凝胶色谱概述 凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC） 分离基于分子在溶液中的体积大小 洗脱次序：大分子先被洗脱 流动相不参与分离，只起溶剂作用 分离效率低 色谱行为容易预测 GPC的校正 液相色谱柱及分离机理的关系 从色谱方法上分 正相 / 反相 离子交换 分子体积排除 亲合 从柱子类型上分 分配 / 吸附 离子交换 凝胶 亲合 液相色谱的方法开发 （二）梯度方法 梯度洗脱的特点 优点 单位时间的分离能力增加 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式 柱需再生 定量分析的重复性较低 如不用梯度：分离不理想 梯度条件的优化 检测器 对检测器的要求 高灵敏度 可重现的设置 合适的带宽 快速或可变的时间常数 宽的线性响应 容易使用及保养 自我诊断功能 检测器的种类 衡量检测器的指标 灵敏度∶ S = △R / △Q △R是检测器响应值的增量 △Q是样品量的增量 噪音∶ 没有样品时检测器的最大输出信号 漂移∶ 检测器在一段时间内响应值的变化 线性动态范围∶最大线性相应与最小检出限之比 最小检测限∶样品产生两或三倍于噪音信号时的浓度 信噪比∶S/N 注意∶最小检测限不是一个单纯的检测器指标。它实际上是评价整个色谱系统的指标，包括了色谱系统、分离机理、色谱柱在内的综合性指标，信噪比亦如此 紫外-可见光检测器 基于样品池(S)中的样品对光产生吸收，有信号差 如是可变波长检测器，还有分光系统(光珊) Beers Law - BEER定律 光能量∶ P0 = 透过溶剂的光能量 P = 透过样品的光能量 光通量(透过率%)∶T=P/P0 吸光度∶ A = -log(T)= log(P0/P) 吸光度 = 单位吸光度 × 流动池长度 × 溶液浓度 即∶ A = abc 同紫外检测器灵敏度有关的因素 信号强度(S) 从BEER定律可看出 样品的种类 样品浓度及进样的体积 检测池的长度 所使用的波长，检测器的时间常数 噪音(N) 流动相 所使用的波长，灯的能量 检测器的时间常数 非检测器因素 - 电噪音，泵脉动等 紫外检测器的溶剂影响 不同种类溶剂有其截止波长 溶剂的质量好坏对其截止波长有影响 为何溶剂质量不好? 含紫外吸收的杂质 溶解在其中的氧气 缓冲液溶质的紫外吸收 示差折光检测器 Differential Refractive Index Detector 示差检测器的注意事项 不能做梯度实验 最大的池耐压是 100 psi 流速范围是 0.3 - 10 ml/min. 液相色谱的定性及定量技术 色谱峰定性 鉴别每个色谱峰 通过比较保留值(通常是保留时间)的方法，找到各色谱峰所对应的组份 大多数情况下用比较保留时间来定性 即所谓： 保留时间相同，可能是同样的组份 保留时间不同，肯定不是同样的组份 用保留时间定性 用“标样”的保留值定出被测组份的位置 进一步的确认 标准加入 同时用其他方法 其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱） 其他检测器 PDA，光谱图比较、谱库检索 MS，质谱图解析、谱库检索 其他仪器方法 定量分析的具体内容 确定样品的类型，主要成分/痕量成分 使分析条件的分离度（R）大于：1.5 色谱峰的定性，峰一致性测定 检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围 用标样建立标准曲线 检查方法的准确度及精确度 用标样定期检查方法 痕量分析 如信/噪比不够，定量的精确度会受影响，因此要： 分析前浓缩样品 选择