试验五溶菌酶的分离与活性测定.pptVIP

碱性磷酸酶（AKP) 的分离纯化及比活性的测定 目的要求 1. 学习碱性磷酸酶分离、纯化及活性测定的原理。 2. 掌握有机溶剂分步沉淀法的基本操作步骤和应用。 实验原理 酶是蛋白质，它的提取、分离与纯化的方法和蛋白质相似，一般有: 中性盐盐析法（如硫酸铵盐析等） 有机溶剂法（如乙醇、丙酮、乙醚提取） 电泳法（如聚丙烯酰胺凝胶电泳等） 层析法（如葡萄糖凝胶层析等） 通常要用多种方法配合使用，才能得到纯净的酶。 分离原理 有机溶剂分级沉淀是分离蛋白质的常用方法之一。 有机溶剂能使许多溶于水的生物大分子发生沉淀，其主要作用是降低水溶液的介电常数。溶液的介电常数降低意味着溶质分子间异性电荷库仑引力增加，从而使溶质的溶解度降低。同时有机溶剂溶于水，对大分子物质表面的水化膜具有破坏作用，最后使这些大分子脱水而互相聚集析出。 沉淀不同物质所需有机溶剂的浓度不同，利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中发生沉淀作用而达到分离。 用于生物大分子分级分离的溶剂主要是能与水互溶的有机溶剂，常用的有乙醇、甲醇和丙酮等。 进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液中有机溶剂达到一定浓度，需加入有机溶剂的浓度和体积可按下式计算： V－需加10 0％有机溶剂的体积 V0－原溶液的体积； S1－原溶液中有机溶剂的浓度；