PCR——聚合酶链式反应.pptVIP

实验28 聚合酶链式反应 生物化学与分子生物学系 Polymerase Chain Reaction, PCR 实 验 目 的 掌握PCR实验的基本原理与操作方法 理解PCR在分子生物实验技术中的重要性 了解引物设计的一般要求 实 验 原 理 基本原理：在体外模拟体内的DNA复制 PCR体系 模板DNA(template) 寡核苷酸引物(primer) 单脱氧核苷酸(dNTP) DNA聚合酶(polymerase) 合适的缓冲液(buffer)系统 目的DNA片段在体外高效、快速、特异地扩增。 PCR过程 变性(denaturation)——DNA双链解链变为单链 退火(annealing)——DNA复性，引物与模板结合 延伸(extension)——引物沿5→3端延伸合成新链 1个循环(cycle) PCR产物的量以指数方式增长 理论上，n个循环后，目的DNA由1个扩增为2n个 Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3 210 = 1024 ≈ 103；220 = 1048576 ≈ 107；240 ≈ 1014 1 mol = 103 mmol = 106 ?mol = 109 nmol = 1012 pmol 模板DNA 产物DNA 10 cycles 20 cycles 40 cycles 1 pmol 1 nmol 10 ?mol 100 mol 实 验 步 骤 ddH2O10×PCR反应缓冲液25 mmol/L MgCl2 4种dNTP的混合试剂 上游引物（Forward） 下游引物（Reverse） Taq DNA聚合酶模板DNA(约1 ng) 50 ?l 35.5 ?l5 ?l 3 ?l 2 ?l 1 ?l 1 ?l 0.5 ?l 2 ?l 1、反应体系的配制 48 ?l 2、PCR反应 20~30 cycles 预变性 变性 退火 延伸 末次延伸 94℃，5 min 94℃，30 sec 54℃，45 sec 72℃，45 sec 72℃，3 min 4种dNTP必须等浓度配合以减少错配误差。 引物设计基本原则： 1、引物与目的片段的序列要紧密互补 2、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 3、引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应 4、长度一般为15-30 bp 5、 引物序列的GC 含量一般为40-60% 变性：一般93℃～94℃ 1min足以使模板DNA变性 退火(复性) ：复性温度=Tm值-(5~10℃)　　　　　 Tm值(解链温度)=4 (G+C)＋2 (A+T) 复性时间一般为30～60sec 延伸：一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃， 延伸速度1000bp/min 循环：一般的循环次数选在30～40。 3、琼脂糖电泳观察结果 15 ?l PCR反应产物，加3 ?l上样缓冲液； 2%琼脂糖凝胶，90~120 mA，电泳20~40 min； 紫外分析仪观察结果。 负 极 正 极 实 验 结 果 Samples Marker (bp) 2500 1500 1000 750 500 250 100 注 意 事 项 1、各种试剂的用量均非常微小，注意微量移液器的 使用，避免不当操作造成的误差； 2、不要在管壁上做标记，以免影响PCR仪的导热性 3、注意琼脂糖凝胶电泳中EB的污染 4、所用的PCR扩增管、枪头都要灭菌。 5、每次实验都要设置阴性和阳性对照。 6、根据引物的融解温度设定退火温度，防止出现 非特异性扩增产物。 共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋 开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子 线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子 质粒DNA的分子构型 (a)松弛线性的DNA； (b)松弛开环的OC构型； (c)超螺旋的SC构型