蛋白质理化性能与纯化.pptVIP

IEC是利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离 凝胶过滤或体积排阻色谱（ SEC）或分子筛层析(molecular sieve filtration) 是利用各蛋白质分子大小不同分离； HIC 是基于用适度疏水性的固定相，以含盐的水溶液作为流动相分离； AFC是基于固定相的配基与生物大分子之间的特殊的生物亲和能力的不同来进行生物大分子相互间的分离。 常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖凝胶等。 （六）利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离 * 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 离心机和离心沉降法分离蛋白质 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 （七）用化学或反向遗传学方法可分析多肽链中氨基酸序列 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 氨基酸和肽末端测定法 离子交换色谱分析蛋白质的氨基酸组分 （八）应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定或预测 1.二级结构测定 通常采用圆二色谱（circular dichroism,CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。a-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰三个成分；而b-折叠的CD谱不很固定。 2. 三维空间结构测定 X射线衍射法（X-ray diffraction)； 核磁共振技术（nuclear magnetic resonance,NMR) 这两种方法是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。 3. 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构 用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质的空间结构； 通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构预测。 三、蛋白质的分析测定 1 凯氏定氮法： a 19世纪丹麦化学家凯道尔所创造的方法，之后 又出现了一系列的改良凯氏法; b 将样品蛋白质的N经消化全部转变为无机氮，测定N的含量，得到蛋白质的含量。 2 双缩脲法 在强碱性溶液中，蛋白质与CuSO4反应，生成紫红色化合物是，其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质分子量和AA组成无关。 (一）含量的测定 3 福林—酚试剂法 a 福林—酚试剂包括两组试剂：碱性铜试剂和磷钼酸和磷钨酸的混合试剂; b 碱性铜试剂与蛋白质产生双缩脲反应; c 反应后的蛋白质的酚基在碱性条件将磷钼酸和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，蓝色的深浅与蛋白含量质成正比。 4 紫外线吸收法 蛋白质中的Tyr、Try在280nm左右具最大吸收，且在各种蛋白质中Tyr、Try含量差别不大，280nm吸收值与浓度具正相关。 1、? SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量 a 电泳中加入SDS（十二烷基硫酸钠，其带的负电 荷量大大超过蛋白质分子电荷量），蛋白质分子的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 b 在实际测定中用己知相对分子质量的单体蛋白质作标准，用Mr和实际迁移率作图，从图上求知Mr。 （三）蛋白质相对分子质量的测定 2 凝胶过滤法测相对分子质量 a 依据蛋白质大小分离蛋白质 b不同Mr洗脱体积Ve不同，在一定条件下： lgMr=K1—K2Ve c 用己知和蛋白质作标准，求出K1、K2 d 由待测样在同一凝胶柱上的Ve，求出其Mr e 要求样品与标准蛋白质具有相同分子形状。 第六节 蛋白质的理化性质与分离纯化 The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein 一、理化性质 （一）蛋白质的两性电离性质