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结肠癌干细胞筛选和其耐药性探究 【摘要】结肠癌干细胞是一小部分存在于结肠癌中 具有自我更新、无限增殖和多项分化潜能的肿瘤干细胞。许 多研究已证实在包括结肠癌在内的多种实体瘤中存在肿瘤 干细胞，它与结肠癌的复发、转移和治疗耐受有着密切的联 系。虽然癌干细胞在肿瘤细胞总数中只占很小比例，但是在 肿瘤的起源、发展、转移以及复发等方面均有重要的作用。 本研究对结肠肿瘤干细胞的筛选及耐药性进行了探讨。 【关键词】肿瘤干细胞；筛选；耐药性 【中图分类号】R739.4【文献标识码】B【文章编号】 1004-4949 (2014) 03-0141-02 1结肠癌干细胞的筛选 1. 1筛选方法 肿瘤干细胞是肿瘤研究中的一大难题，其中最困难的是 如何从肿瘤组织中分离出肿瘤干细胞。目前，分离和纯化肿 瘤干细胞的方法主要有三种，但各有各的优缺点。一是无血 清培养形成细胞球，亦是富集肿瘤干细胞的方荧；二是荧光 染料法，但此种方法有一定的局限性；三是表面标志分子筛 选法，又可分为流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法。这两 种方法均利用肿瘤干细胞表面特异的标志分子与带有标志 的抗体结合，从而使其与非肿瘤干细胞分离。 1.2筛选过程 采用干细胞球培养法筛选结肠癌干细胞时，要取生长状 态良好的结肠癌细胞制成单细胞悬液并计数，取单个细胞放 入肿瘤干细胞培养基中悬浮培养，每天晃动几次，防止细胞 贴壁，待细胞球变大，亮度降低，结构变松散时用酶消化传 代，取亲本及传代后细胞放入孔板中培养后，计算成球率。 取生长状态良好的结肠癌干细胞球置于含有牛血清的中培 养，观察细胞贴壁分化情况进行磁珠分选。磁珠分选后，采 用流式细胞术检测分选后细胞中含有表面抗原分子细胞含 量。为了检测结肠癌细胞形成的癌细胞克隆球的抗原分子蛋 白表达情况，接种后第6天克隆细胞球被采用免疫荧光检测。 将分选后的细胞分别接种于无血清培养基中，检测标记细胞 的体外增殖能力。 1. 3标志分子的功能及其在结肠癌干细胞筛选中的应用 筛选结肠癌干细胞的标志分子大部分根据其表迗水平 而定，但标志分子在肿瘤干细胞中的功能尚不清楚。尽管结 肠癌一直被认为起源于肿瘤干细胞，但因缺乏可靠的生物学 标记，直到最近这个假说才得以证实。表面抗原分子是第一 个用于筛选结肠癌干细胞的表面标志分子，是维持肿瘤干细 胞干性的重要分子。以表面抗原分子筛选所得到的结肠癌细 胞经鉴定具有体内成瘤能力，然而有研究发现表面抗原分子 和转移后的结肠癌细胞都具有体内成瘤能力，这使利用表面 抗原分子筛选结肠癌干细胞令人质疑。因此，利用表面抗原 分子来筛选肿瘤干细胞需进一步的验证。跨膜糖蛋白是另一 个在肿瘤中运用广泛的筛选肿瘤干细胞的标志分子，也是第 一个应用于判断肿瘤放射治疗疗效的干细胞标志分子根据 跨膜糖蛋白的表迗来判断肿瘤组织中肿瘤干细胞的密度，从 而就能达到预测放射治疗的效果。研究发现肿瘤干细胞标志 分子在诱导与维持细胞与基质之间的链接起着重要作用，同 时也能增强肿瘤细胞在新环境的增殖能力。 2结肠癌干细胞的耐药性研究 2. 1引起肿瘤干细胞产生耐药性的原因 恶性肿瘤的治疗方法主要有手术、化疗和放疗。其中化 疗是最主要的治疗手段。但由于肿瘤干细胞可以产生耐药 性，使得肿瘤可以对多种化疗药物产生耐受，最终导致化疗 失败。导致肿瘤干细胞产生耐药性的主要原因有以下几点。 一是高表迗转运蛋白可以参与多种跨膜转运过程，将糖类、 脂类、氨基酸及细胞毒性药物等大分子物质逆浓度梯度转运 到细胞外；二是肿瘤干细胞通常很少处于细胞生长的增殖 期，当其收到一定刺激时会重新进入有丝分裂期，造成肿瘤 复发；三是临床上常用的化疗药物的作用机制之一是诱导细 胞凋亡，而肿瘤干细胞内细胞凋亡受到抑制，对这类化疗药 物不敏感；另外，化疗药物的作用靶点通常是DNA，而肿瘤 干细胞内的多种酶可以促进DNA的损坏修复功能，使肿瘤干 细胞无法收到这类药物的作用。 2.2肿瘤干细胞的耐药性实验及结论 可靠的肿瘤干细胞筛选将为肿瘤干细胞干性及分化信 号通路调节机制研究奠定基础。经实验证实，结癌干细胞对 传统化学治疗药物比一般的肿瘤细胞具有更强的耐受性。处 于静止期或慢周期状态是成体干细胞的一个重要特点，研究 表明肿瘤干细胞也大多处于静止状态，并参与了肿瘤的耐 药、复发和转移。细胞周期检测发现干细胞中处于静止期的 细胞要明显多于亲本细胞，一方面表明肿瘤干细胞与成体干 细胞的相似性，另一方面也进一步解释了肿瘤干细胞对细胞 周期特异性药物的耐药性。实验结果还显示了结肠癌干细胞 富集与耐药的相关性。干细胞球细胞对不同药物的耐药性均 明显高于亲本细胞，其中细胞处于静止期使细胞对药物周期 特异性的耐药，而表达升高使细胞对不同种药物均耐受，表 现出多药耐药性。结肠癌治疗多年后复发及远处转移都与残 留的结肠癌