纤维素酶的发酵生产实验报告.docVIP

实验二、黑曲霉发酵生产纤维素酶大实验 一、 实验目的 1、 了解纤维素酶的生产工艺和原理 2、 掌握液体发酵和固体发酵工艺 3、 学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理 二、 实验原理 纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有广阔的应用前景。高产纤维素 酶的微牛物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中B-葡萄糖背酶活力 高，能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且安全无毒，故而成为生产纤维素酶的主要 菌种Z-o纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂。 以竣甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解液中的还 原糖含量（以葡萄糖计），可以计算酶活力高低。还原糖与DNS反应形成棕色物质，颜色深 浅与糖含量成正比。 三、 材料与试剂配制 1 生产菌种：黑曲霉 2、斜面（活化）培养基：酵母膏0. 4%,蛋白月东0.6%,可溶性淀粉1%,葡萄糖0. 9%,马 玲薯浸出液7%,琼脂2%,陈海水（或人工海水）配制，pH7. 0-7. 4o 3、人工海水：NaCl = 24 g/L ; MgSO, - 7H2 0 = 7. 0 g/L ;NH4NO3 = 1 g/L ;KC1 = 0. 7 g/ L ; NaH2PO4 = 2. 0 g/ L ;Na2HP04 =3.0 g/ L , pH7? 4。 4、 微量元素液:FeSO4 ? 7H20 5. Omg/L, MnSO4 ? H20 1. 6mg/L, ZnS04 ? 7H20 1.4mg/L, CoCl2 2. Omg/L,加蒸憾水200ml使之溶解。 5、 液体发酵产酶培养基：隸皮作碳源3 g,氯化钱或硫酸钱作无机氮源1 g,蛋白陈 0?05g作有机氮源，人工海水100 ml （含1%微量元素液），自然pll值。 6、 固体发酵产酶培养基：鉄皮：稻草粉二2： 1作碳源5 g,人工海水12 ml （含1%微 量元素液，1%氯化鞍或硫酸鞍，0. 05%蛋白月东）,自然pH值。 7、 6% DNS试剂：称取酒石酸钾钠182g溶于500nd水中，加热溶解，于热溶液中依次 加入3, 5-二硝基水杨酸6g, 20. SgNaOH, 5g苯酚,5g无水亚硫酸钠,加热搅拌溶解,冷却 后定容至1000mlo储存在棕色瓶中放置一周后使用。（提前配制） 8、0. 1 mol/L柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液(pH 4. 8) 0. lmol/L柠檬酸钠溶液lOOmL:称2. 941克柠檬酸钠(柠檬酸钠的分子量为294. 12), 约20L蒸憎水溶解后，转入lOOmL溶量瓶，定容至刻度。 0. lmol/L柠檬酸溶液lOOmL:称2. 101克柠檬酸(柠檬酸的分子量为210. 14),约20L 蒸憾水溶解后，转入100mL溶量瓶，定容至刻度。 PH4.8的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液100mL:量取0. lmol/L柠檬酸钠溶液54mL和 0. lmol/L柠檬酸溶液46mL混合摇匀。 1%CMC-Na 溶液 称取1. 0克竣甲基纤维素纳，用pH 4.8的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液加热溶解。 lmg. mL-1标准葡萄糖溶液 lmg/mL葡萄糖溶液250mL:准确称取无水葡萄糖250mg,溶解定容到250ml。 11、主要仪器：恒温培养箱，摇床培养箱，可见光分光光度计、冷冻离心机、电子天 平等。 四、实验步骤 1、 培养基配制 分别按上述方法配制液体发酵培养基和固体发酵培养基，121°C灭菌20分钟。 2、 抱子悬液的制备：将斜面培养基上的曲霉苞子用少量无菌人工海水洗下，利用玻璃 珠在磁力搅拌下搅拌15~20分钟，充分打散孑包子，稀释成5x10,个/讯左右的抱子悬液。 2、液体发酵产酶试验 按6% (v/v )接种量将浓度约为5X10 了个/ml的菌株砲子悬液接入已灭菌的液体发 酵培养基(100 ml锥瓶装液30 ml),于35°C、180r/min条件下摇床培养6天。发酵液4°C、 5000 r/min离心15 min,上清液稀释10倍，测定发酵液中的酶活力。 3、 固体发酵产酶试验 100 ml三角烧瓶装5g已灭菌的固体发酵培养基，按1:3 (v/w)接种量将浓度约为5X10 7 个/ml的菌株泡子悬液，于35°C恒温培养箱中培养，接种48小时后隔天翻曲一次，第四或第 五天补充无菌水保持基质水分。培养6天后，取发酵成熟曲lg,加蒸徭水10ml,搅拌均匀， 30°C,浸提lh,双层纱布过滤，滤液经4°C, 5000rmp离心15min,上清为粗酶液。测定时适 当分级稀释，使OD54。在0?2~1?0范围。 4、 酶活力测定及酶活力定义 (!)葡萄糖标准曲线绘制 准确称取无水葡萄糖250mg,溶解定容到250mlo分别吸取此液1?0, 2.0, 3. 0, 4. 0, 5.0