一种新的构建重组慢病毒方法的建立.pdf

摘 要 慢病毒载体因为可以介导外源基因在非分裂细胞中稳定高效地表达而成为 转基因动物和基因治疗研究的重要工具。本实验以人免疫缺陷病毒(HIV-1)的复 制缺陷型载体系统为研究材料，该载体系统包括4个质粒，由编码病毒的核心蛋 白包括基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白的基因gag和编码病毒复制所需要的酶 陷型的慢病毒，但费时、费力和得到的病毒滴度较低是这种方法的主要缺点。 本研究提出了一种全新的包装慢病毒的方法，即借助伪狂犬病毒载体的共感 染生产慢病毒载体。首先对慢病毒基因转移载体进行改造，得到了一个可表达绿 色荧光蛋白基因的重组基因转移载体质粒(pLenti6EGFP)，并将其与3个辅助质 粒共转染得到了表达绿色荧光蛋白的慢病毒。然后将上述四个质粒上的pUCl8 复制子换成了适用于接合转移的条件型R6K复制子，然后用MAGIC的方法分别 将这4个质粒上的元件转移到BAC化的伪狂犬病毒(PRV)载体上，得到4种重 载体。然后这四种包含慢病毒包装元件的四种伪狂犬病毒共感染PKl5细胞，得 到表达了带外源表达GFP基因的重组慢病毒载体。 本实验还结合了大肠杆菌介导的对哺乳动物的基因转移，即用含有4种目的 质粒和PGBO／／nv—h／y的大肠杆菌DHl0B菌株分别与哺乳动物细胞混合培养，包 装伪狂犬病毒。这样我们获得重组慢病毒的过程就不需要使用转染试剂，并且省 去了质粒的制备，大大的降低了慢病毒的生产成本。 关键词：伪狂犬病毒BAC载体慢病毒载体病毒感染 Abstract Lentivirals effectivemeansfor of in provides expressionexogenousgenes and mammalian had efficientachievedstable cells，whichprovid long—termexpression the itwas asan vectorfor of developedimportanttransgenic transgenic transgenes，SO animalsand this choosethe lentiviral genetherapy．Instudy,we repliacation—defective vector whichbasedonHIV-lastheResearchmaterial．Thisvector system system consistof includefour vector packaging gag／pol plasmids：(1)pLPl：the Rev plasmidencoding plasmidencodingprotein；(3)pLP—VSVG：the gene；(2)pLP2：the virus transfer thevesicularstomatitis vector the lentiviralvectors．LentiviralsCallbe by transgene