红豆杉细胞中紫杉醇的分离纯化新工艺研究.pdfVIP

华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 受较为严重的人为破坏。云南、四川两省在交通方便的地方，红豆杉被采剥的现象 都有不同程度的发生。如云南志奔山，曾有9.2万株被剥去树皮，被盗剥的树皮达1321 [7] 吨，使这一地区红豆杉濒临灭绝 。因此，寻找紫杉醇的新来源已成为紫杉醇研究开 [8] 发的热点 。目前，对解决此问题的研究方向有利用植物中的类似物进行紫杉醇的半 合成，利用廉价物质进行全合成，规模种植，细胞培养等。 1994年，Nicolaou博士领导的一个美国研究小组报道了紫杉醇全合成的结果，但 [9] 。以红豆杉枝叶中提取的中间体10-DAB （10-去乙酰基 目前尚不具备商业应用价值 - 巴卡亭III ）为原料，经过4步可半合成紫杉醇，半合成已是解决药源不足的重要补充 途经[8-9] 。 尽管半合成工艺趋近成熟，但药源问题依然是紫杉醇成品药价格居高不下，供不 应求的瓶颈问题。因此，解决药源问题是从根本上解决价格问题的前提。 目前普遍认为植物细胞培养法生产紫杉醇是解决紫杉醇药源问题最有前景的途 径之一[10] 。它具有以下优点：不受气候、地域等因素的影响；除提供紫杉醇外，还 可以为半合成提供前体10-DABⅢ和DABⅢ （去乙酰基巴卡亭III ）；人工培养的细胞 中紫杉烷谱分布简单，可以大大简化分离和纯化步骤；可以在生物反应器中进行大 规模培养；更为重要的是可以通过诱导方式大大提高紫杉烷类物质的产量。 由于细胞培养法尚在尝试阶段，因此目前工业上分离纯化紫杉醇的主要方法依 然是从从植物组织（根、茎、叶等）萃取后，用一系列色谱工艺分离与纯化。具体 为醇提，有机萃取，硅胶柱层析，最后为制备HPLC 。随着制药原材料改进为人工培 养细胞后，细胞各组分含量与植物组织有较大改变，因此探索适合新原料来源的、 更加有效、环保、安全的新工艺非常必要。 1.2 紫杉醇分离纯化紫杉醇分离纯化研究进展研究进展 紫杉醇分离纯化紫杉醇分离纯化研究进展研究进展 各种常见的分离方法均运用于紫杉醇的大规模分离工艺中，而许多先进的分离方 法也在探索与尝试中，几种常见的分离工艺如下： 2 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 1.2.1 浸提与萃取浸提与萃取 浸提与萃取浸提与萃取 目前工业上分离纯化紫杉醇的主要方法是从从植物组织（根、茎、叶等）萃取 后，用一系列色谱工艺分离与纯化。具体步骤可大致分为提取，有机（液-液）萃取， 数步硅胶柱层析，最后为制备 HPLC 精制。各工艺步骤均有较成熟与较理论的方法， 具体如下。 1.2.2.1 浸提 分离纯化紫杉醇的第一步是用有机溶剂对组织材料进行浸提。浸提的机制，是用 有机溶剂的极性、溶解性、穿透性等性质，将组织材料中的目标物质溶解到溶剂中， 然后用过滤操作将固体与液体分离，在回收滤液中的溶剂后得到浸膏[11] 。浸膏中的 目标物质的浓度已比原料中提高10-1000倍左右不等，并可较有效的将原料中的蛋白 质，糖类，纤维素，色素，脂类等保留在滤渣中。对于从红豆杉中提取紫杉醇，在 乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、乙醚、二氯甲烷、氯仿等7种溶剂中，单一溶剂的浸 取效果以甲醇最好，而乙醚、氯仿、二氯甲烷浸取效果较差[12] 。另外针对混合溶剂 也作了系统研究，结果表明，在乙酸乙酯、乙醚、丙酮、甲醇和乙酸乙酯：丙酮等 溶剂中，以乙酸乙酯：丙酮(1:1)的提取效果最好[13] 。 对红豆杉材料的一次浸提并不能完全将目标物有效提取，因此需对滤渣进行洗 涤。对于洗涤次数，是否结合超声波，是否加热，提取时间等各方面工艺均有研究 与报道[14] 。 另外，对于浸提步骤，有许多独特与扩展的研究。曾有报道，首先用含有2O ％～ 50 ％水分的乙醇溶液浸提未经干燥的新鲜枝叶，然后再加入占浸提液体积3 ％～5 ％ 的活性炭处理浸提液，最后经过一系列的硅胶柱层析就可以得到纯度为100％ 的紫 杉醇。这一方法具有一定的创新性，其优越之处为可免去干燥枝叶这