细胞生物学综合性实验报告.docVIP

植物原生质体的分离、纯化及融合 引言 原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。 分离原生质体采用酶解法。其原理是根据由纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组分，以及原生质体收集方法有关。酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯既，然后进行培养。 不同种植物的原生质体可在人工诱导条件下融合，所产生的杂种细胞，即异核体经过培养可再生新壁，分裂形成愈伤组织，进而分化产生杂种植株。由于进行融合的原生质体来自体细胞，故该项技术也叫体细胞杂交。原生质体融合能使有性杂交不亲合的植物种间进行广泛的遗传重组，因而在农业育种上具有巨大的潜力。在植物遗传操作研究中也是关键技术之一。人工诱导原生质体融合可使用物理学方法，如运用细胞融合仪，在电场诱因导下实现融合，然而至今广为使用的仍是聚乙二醇（）溶液引起原生质体的聚集和粘连，然后用高钙溶液相处理的化学方法（等，）。该法应用分子量至为的聚乙二醇（）溶液引起原生质体的聚集和粘连，然后用高的钙溶液稀释时，就产生了高频率的融合，融合的频率和省略常与所有的分子量、浓度，作用时间，原生质体的生理状态与密度以及操作者的细心程度有关。 材料、试剂与方法 材料 菠菜叶片,唐古特白刺愈伤组织,金盏菊花瓣。 试剂 . ％酒精。 . ％升汞水溶液，并滴入少许 。 . 灭菌蒸馏水。 . ／和／ ·溶液，并加有％（吗啉已烷磺酸），。 . ％和％蔗糖溶液， 。 . 酶液 纤维素酶(， ％ 果胶酶(，) (若用国产纤维索酶，则果胶酶可省去。) 甘露醇 ／ · ／ ％ ．～． ．酶液 纤维素酶( ) ％ 离析酶( ) ％ 半纤维素酶(，) ％ 甘露醇 ／ · ％ ～ ．溶液 . 高，高钙稀释液 方法 .3.1 . 取充分展开的叶片和花瓣，用自来水冲洗干净。(以下步骤均在超净台上进行)。 . 将叶片在·％升汞溶液中浸泡灭菌，中间摇动几次。取出后用无菌蒸馏水漂洗次 . 将叶片移入大培养皿中，用吸水纸吸去上面的水珠。然后将叶背面朝上，小心用镊子撕去下表皮。 .3.2 . 将撕去下表皮后的叶片放进预先放有酶液的培养皿或带盖兰角瓶中，每酶液约放叶片。若叶片不易撕下下表皮，可用锋利的解剖刀将叶片切成约宽的小条，放入酶液。 . 将培养皿用石蜡膜带封口，在℃条件下保温～，中间轻轻摇动～ 。在倒置显微镜下检查，直到产生足够量的原生质体。 .3. . 将酶解后的原生质体悬浮液用不锈钢网筛过滤到小烧杯中，以除去未酶解完全的组织。 . 将滤液分装在刻度离心管中，用／的速度离心，使原生质体沉淀下来。 . 用移液管吸去上清液。将沉淀的原生质体悬浮在 ／的·中。 . 用注射糙伸长针头向离心管生部缓缓注入％蔗糖溶液，在／下离心。此步完成后，在两相溶液的界面之间将出现一层纯净的完整原生质体带，杂质，碎片将沉到管底。 . 注射器吸出管底杂质和下部的蔗糖溶液及上部的·溶液。 . 离心管中留下的纯净原生质体用 ／的·悬浮。离心离心，吸去上清液。再用培养基如法洗涤一次。 .3. ． 将收集的两种不同材料的原生质体分别悬浮在的· ． 将两种原生质体悬液等量混合。 ． 用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为的平皿中，每皿滴滴，每滴约。然后静置，使原生质体贴壁。 ． 用吸管将等量的溶液缓慢地加在原生质体液滴上，再静置。此