多种植物总dna提取方法及详细步骤.docVIP

植物总DNA提取 一、常用方法 改良CTAB法（改良自精编分子生物学实验指南，原蓝猪耳实验方案，拟采用） 植物基因工程，王关林，2002 SDS法（植物基因工程，王关林，2002） 高盐低pH值法（邹喻萍，植物学报，1994） 材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖 材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖 材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖 材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖 试剂： 2-巯基乙醇（2-ME） CTAB抽提液 CTAB/ NaCl溶液 24：1（V/V）氯仿/异戊醇 CTAB沉淀液 高盐TE缓冲液 70％乙醇 TE缓冲液 试剂： 2×CTAB提取缓冲液 试剂： 提取缓冲液：100mmol/L Tris·Cl（pH8.0）、50mmol/L EDTA（pH8.0）、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L 2-巯基乙醇（2-ME） 10% SDS 5mol/L KAC 试剂： 提取缓冲液：100mmol/L NaAC（pH 4.8）、50 mmol/L EDTA（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、1.4％ SDS，此种介质刚好为pH 5.5。 2.5mol/L KAc（pH 4.8） 操作： 称取样品0.2g，去除表面的DNA污染，置于研钵中与液氮共研成细粉。 将冻粉转入2ml离心管中，立即加入1000μl（980＋20）预热至65℃的CTAB抽提液，于65 ℃温育30min（10~ 放至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提匀浆液，颠倒使充分混合，于4℃，7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 r/min） 将上清液转移至新的离心管中，加入1/10体积的65℃的CTAB/NaCl溶液，颠倒充分 再次加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），颠倒使充分混合，于4℃，7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 r/min） 将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀，室温放置15min后（如果沉淀可见，继续做，否则于65 ℃温育30 min），于4℃，10000 r/min离心5 将残液尽可能除尽，加入200μl的高盐TE缓冲液和2μl RNaseA储备液重悬沉淀，于37℃温育30min 加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀，于4℃, 7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 r/min 将沉淀用70%乙醇清洗两次后，晾干，加入50μl TE溶解沉淀。 操作： 2ml离心管中加入1ml提取缓冲液，65℃ 取0.2g新鲜幼嫩叶片，于液氮中迅速研磨成粉。 将呈干粉状态的研磨物迅速转入提取缓冲液中，尽快混匀，于65℃保温30min。其间轻柔混匀2~3 取出离心管，冷至室温，加入1ml的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀，静置10min。 10 000r/min离心10 min。 转移上清液于另一离心管中，加入2/3倍体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温放置15min。 10 000r/min离心10 min，去上清液。 用0.2ml 70％乙醇洗涤沉淀1次，室温下微干，加入70μl 高盐TE缓冲液和1 μl的RNaseA，颠倒混匀，37℃保温0.5h 加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀，于4℃, 7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 r/min 将沉淀用70%乙醇清洗两次后，晾干，加入50μl TE溶解沉淀。 操作： 称取样品0.4g，去除表面的 将冻粉转入2ml离心管中，加入提取缓冲液900μl（自注：观察此用量合适否），轻轻搅动，使冻粉充分散开。 加入400μl 10％SDS，充分混匀，于65℃水浴中保温10～15min（间隔晃动2～3次）（自注：若裂解不充分可延长时间） 加入640μl 5 mol/L KAC，充分混匀，冰浴中放置30min。 4℃ 12 000rpm离心15min 上清液转入新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管数次，放置5min。 于4℃下8 000rpm离心10min 上清液转入新的离心管中，加入2/3体积、-20℃预冷的异丙醇，混匀，放置30min，观察DNA 于4℃下8 000rpm离心10min，去上清液。 用80％的乙醇洗涤沉淀，晾干10～15min。 加入400μl TE缓冲液充分溶解沉淀（若溶解不好，可置37℃ 5 000rpm离心5min，上清液转入新的离心管（去除不溶物）。加入10μl RNaseA溶液（1μg/μl），于37℃