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PAGE PAGE 51 第十四章 常用酶类测定 第一节 氧化还原酶类 氧化还原酶能够催化氢氧原子或电子从一种底物转移到另一种底物上，它包括一大类酶如脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶以及加单氧酶等。目前临床诊断中常用的氧化还原酶主要有乳酸脱氢酶及其同工酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、铜蓝蛋白、单胺氧化酶和超氧化物歧化酶等。 实验92 连续监测法测定乳酸脱氢酶总活性(L-P反应法) 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LD)是糖酵解和糖异生的一个重要酶，含有锌离子，广泛分布于人和动物组织、植物和微生物中，能可逆地催化乳酸(L)和丙酮酸(P)之间的氧化还原反应。 乳酸+NAD+ 丙酮酸+NADH+H+ 其中L→P为正向反应，P→为逆向反应。正反两向反应的最适pH不同，其中正向反应最适pH为8.8～9.8，偏碱，能使平衡偏向生成丙酮酸的方向。其优点是乳酸和NAD+稳定性好，且NAD+纯品易得、价格较低，过量乳酸对LD活性的抑制较小，反应线性较好。缺点是需要较高的底物浓度，反应速度较慢。 逆向反应的最适pH为7.4～7.8，与生理性pH相同。其显著的优点在于NADH用量少，仅为正向反应的3%左右，而反应速度比前者约快3倍，灵敏度高。但丙酮酸于NADH的稳定性较差，过量的丙酮酸对LD活性的抑制作用较大。 LD活性测定时正向反应和逆向反应都可以运用，但1996年中华医学会检验学会酶学组专家推荐选择正向反应。 【原理】 LD催化下述反应： 在反应过程中，乳酸氧化生成丙酮酸，同时使NAD+还原为NADH。NADH在340nm处有吸收峰，因此反应会引起340nm吸光度的增高，并且吸光度增加的速率与样本中LD活性呈正比的关系。 【试剂与器材】 1．Tris-乳酸锂缓冲液(含Tris 52.5mmol/L，乳酸锂52.5mmol/L) 称取Tris 6.34g，乳酸锂5.04g，溶于约800ml 蒸馏水中，置37℃水浴箱，使温度达到平衡后，在pH计下用1mol/L的HCl(约加入45ml)调节pH至8.9，再加入蒸馏水至1 000ml，冰箱保存。 2． 底物应用液(含Tris 52.5mmol/L，乳酸锂52.5mmol/L，NAD+ 6mmol/L，临用前现配) 1ml Tris-乳酸锂缓冲液加4.2mg NAD+的浓度比例配制。 3．仪器以半自动生化分析仪为例。 【操作步骤】 1．血清稀释度 血清50μl，加37℃预温的底物应用液1.0ml，立即吸入自动分析仪，此时血清稀释倍数为21。 2．主要参数： 系数　　3 376 孵育时间　　30s 连续检测时间　　60s 波长　　340nm 吸样量　　0.5ml 温度　　37℃ 【计算】 式中，△A/min：平均每分钟吸光度增加值；6220:340nm处NADH的微摩尔吸光系数；1.05：比色液体总体积(ml)；0.05：血清用量(ml)。 【参考范围】 成人109～245 U/L。 【临床意义】 LD活性增高主要见于心肌梗死、肺梗塞、病毒性肝炎、肝硬化、肾脏疾病、某些恶性肿瘤、白血病、以及非恶性疾病如传染性单核细胞增多症、贫血、肌营养不良、胰腺炎等，一些肿瘤转移所致的胸腹水中LD活性往往有升高。目前临床测定LD活性常用于心肌梗死、肝病和恶性肿瘤的辅助诊断。 LD活性降低目前没有发现重要的临床意义。 【注意事项】 1．不同的LD同工酶对温度的敏感性是不同的，组织提取液若放于－20℃过夜，LD4和LD5会丧失全部的活性。血清标本应存放于室温下，一般2～3d不会出现活性的丢失。如果血清标本需要存放较长时间，应加入10mg/ml的NAD+或3.1mg/ml的谷胱甘肽后于4℃保存。 2．LD活性测定也可用抗凝血浆，但不同抗凝剂对LD测定的影响不同：草酸盐抗凝剂、EDTA能抑制LD活性，而肝素的影响不大。 3．由于红细胞、血小板中含有大量的LDH，故严禁使用溶血标本。在采用血浆作为标本时必须用3 000r/min离心15min以除去血小板。 4．LD活性能被巯基试剂所抑制，硼酸、丙二酸、草酸、以及EDTA都是竞争性抑制剂。 【评价】 1．LD广泛存在于人体各组织的细胞浆中，以肝、心肌、肾、骨骼肌、胰腺和肺含量最多。各组织、器官中酶活性是血清酶活性的1 000倍，因此各种组织病变时可以释放LD入血，导致血清中酶活性的升高，特异性较差。 2．本实验是根据正向反应(L-P)建立的连续监测法，其优点在于：乳酸盐与NAD+底物溶液的稳定性较好，冰冻放置可稳定6个月以上。且两溶液的浓度对测定方法的影响最小，NAD较少被产物抑制。反应的线性范围较宽(726U/L)，重复性较好，精密度较高(LD为65U/L时日间CV%为5.8%，LD为149U/L时日间CV为3.2%)，特异性