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第四节 基因定点诱变
2.4.1 盒式诱变
利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段取代野生型基因中的相应序列.
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2.4.2 寡核苷酸引物诱变
使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物,启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分。
寡核苷酸引物诱变过程
正链DNA合成
突变引物合成
异源双链DNA分子制备
闭环异源双链DNA分子富集
转化
突变体筛选
寡核苷酸引物诱变法的局限性
异源双链DNA分子并非真正异源
突变体子代中突变碱基被错配修复体系修复
提高寡核苷酸引物诱变突变效率的方法
Kunkel 定点诱变法: 1985年由T.A.Kunkel发明
ung:尿嘧啶脱糖苷酶
硫代磷酸诱变法: 已知有些限制酶不能切割硫代磷酸DNA分子．在异源双链DNA分子制备时，加入硫代核苷酸，使之掺入突变链中．然后用前述酶切割，并用外切酶局部消化后，进行聚合反应，从而产生具有定点突变的异源双链DNA
2.4.３ ＰＣＲ诱变
(1) 重组PCR定点诱变:克服寡核苷酸引物诱变能力仅限于5’端.
特点:经3轮PCR反应,一对互补的带有突变碱基的内侧引物和2个外侧引物
(2) 大引物诱变:核心是第一轮PCR产物为第二轮PCR引物
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