罗氏沼虾两种不同的热休克蛋白70分子生物学特征和功能-细胞生物学专业论文.docxVIP

浙江大学博士学位论文 浙江大学博士学位论文 罗氏沼虾两种不同的热休克蛋白70分子生物学特征和功能 摘 要 热休克蛋白70是热休克蛋白家族中最重要豹一类家族成员，它具有“分子伴 侣”、细胞保护、抗凋亡以及肿瘤免疫治疗等独特复杂的生物学功能，因此，它 的研究已成为生命科学领域研究的热点之一。 目前热休克蛋白70的研究主要集中在高等脊椎动物上，而对于无脊椎动物， 尤其是有关水生无脊椎动物热休克蛋白70的研究却比较少。众所周知．水生动 物广泛生活在水环境中，它们与环境之间的关系是最为密切的，而这种密切的关 系很大程度是依赖热体克蛋白70来实现的，因此，研究热休克蛋白70与水生动 物对环境的适应性和耐受性之问的关系是非常有意义的。 本研究以具有重要经济价值的淡水虾类一罗氏沼虾作为研究对象，从35。C热 诱导后的中枢神经和肝胰腺两种组织中分别克隆到两种热休克蛋白70s基因，它 们的eDNA长度是2448和2173bp，含有1950和1734bp的编码区，分别编码649 (Mr约为71kDa)和577个(Mr约为65kDa)氨基酸的两种多肽分子，命名为 Mar—HSC70和Mar-HSP70。氨基酸序列比对分析表明它们和其他物种HSP70s有很 高的同源性，故确定它们属于HSP70家族成员。研究中发现Mar—HSC70和 Mar—HSP70氨基酸序列最主要的差别在于Mar—HSP70 N-末端和c-末端分别有60 和14个氨基酸残基的缺失，而这种缺失经过多次测序得以确认。基因组结构分 析表明这两种HSP70s均不含有内含子结构。 运用Northern blotting、western blotting和半定量RT—PCR分子生物学手 段，从mRNA和蛋白两种水平上分析了Mar—HSC70和Mar—HSP70在冷热休克、重 金属诱导以及细菌侵染情况下它们的表达特征，结果表明：Mar-HSC70基因在各 种应激条件下表达水平基本没有发生改变，各组织间表达水平比较发现 Mar-HSC70主要卵巢组织中大量积累；而对于Mar-HSP70 mRNA水平仅对35℃热 刺激才大量增加，并且这种上调主要集中在中枢神经、肝胰腺和肌肉组织中；半 定量RT—PCR检测结果表明Mar—HSP70在15，20，25和30℃也有低水平表达； Western blotting检测结果进一步证明了Mar-HSP70这种小分子量HSP70s(Mw 约为65kDa)在热刺激后的大量表达。这些结果说明Mar-HSC70以组成型方式进 行表达，而Mar—HSPTO则以诱导型方式进行表达，并且这种表达具热的特异性， 浙江大学博士学位论文 浙江大学博士学位论文 罗氏沼虾两种不同的热休克蛋白70分子生物学特征和功能 这种特殊的表达方式说明Mar—HSP70在罗氏沼虾热损伤保护中起着极其重要的 作用，同时我们推测Mar-HSP70这种独特的功能可能与其N一末端和c-末端的缺 失结构相关。 为了进一步分析这两种分子在胞内的表达情况，我们采用原位杂交和免疫组 织化学在中枢神经和肝胰腺两种组织中进行了表达定位研究，结果表明： Mar—HSC70和热诱导后的Mar—HSP70在绝大多数细胞都有表达，尤其是在神经分 泌细胞和肝胰腺的R和F细胞中表达水平较高，并且热诱导后的Mar—HSP70的表 达水平远高于Mar—HSc70，这些结果进一步表明Mar—HSP70在热应激保护中扮演 着重要的角色，同时也说明热应激条件下，绝大部分细胞快速启动这种基因的表 达。 为了进一步探讨罗氏沼虾这种诱导型Mar_HSP70的功能，我们构建了 MarHSP70一pET一28a(+)原核表达系统，成功地表达了Mar-HSP70，发现在IPTG 诱导5hr后，目的蛋白可达到细菌总蛋白的50％以上，同时通过免疫印迹技术 证明了这种蛋白的免疫原性，而且通过优化条件，采用低温诱导，获得了一定量 可溶性Mar—HSP70。在Mar—HSP70功能分析中，我们建立了Mar—HSP70的活性检 测系统，在卫coli BL21(DE3)导入这一基因并诱导表达，发现能够提高热刺激 后细菌的生存率，这说明M”一HSP70在一定程度上起到了对细菌的保护作用，这 为诱导型HSP70s功能研究提供了很好的模型和思路。 总之，这是第一次从虾类中克隆到两种热休克蛋白70s基因，并研究了它们 的表达特征及可能的功能，这两个基因具有大多数物种HSP70s的共性，而更重 要的是，它们自身的特殊性，这些特殊性对于认识水生无脊椎动物HSP70s的结 构及功能有着重要的理论价值和研究前景。 关键词：罗氏沼虾，热休克蛋白70kDa，热休克，表达分析和定位，原核表达， 活性检测 塑翌奎兰堕主兰