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手足口病的实验诊断 安徽省疾病预防控制中心 2009 . 3 . 11 手足口病的病原 手足口病（hand-foot-mouth disease, HFMD）由人肠道病毒感染引起。 人肠道病毒为小RNA病毒科（Picornaviridae），肠道病毒属（Enterovirus）的一组单股正链RNA病毒。其中包括埃可病毒（31个血清型）、柯萨奇病毒A组（23个血清型）和B组（5个血清型），还包括3个脊髓灰质炎病毒血清型和人肠道病毒68-71型。 人肠道病毒发现的历史 脊髓灰质炎病毒：1909年首次鉴定出该病毒，1949年，利用细胞培养的方法增殖病毒，为疫苗的研制奠定了基础。 柯萨奇病毒：1948年在美国纽约Coxsackie镇，将两名麻痹患儿的标本接种至乳鼠体内，分离出来的一组病毒定名为柯萨奇病毒。根据它们在乳鼠上产生的组织病理学变化和在细胞培养上的能力，分为柯萨奇病毒A组和B组。 埃可病毒：1951年在一名无症状的儿童的粪便标本中分离到，在细胞培养上可以造成致细胞病变，但对乳鼠和灵长类动物不致病。 新肠道病毒：随后新发现的病毒被按照序号命名（69~71），最近，已经命名至102型 肠道病毒主要血清型 手足口病的常见致病病原 多种肠道病毒都可引起HFMD，主要为： 柯萨奇病毒A组的4～7、9、10、16型 B组的1～3、5型 埃可病毒的部分血清型 肠道病毒71型 最常见的为CV-A16和EV71 肠道病毒的抵抗力 肠道病毒无包膜，乙醚、75%酒精、表面活性剂等均不能将其灭活。 对紫外线及干燥敏感；各种氧化剂（高锰酸钾、漂白粉等）、甲醛或56℃ 30min都能灭活病毒 病毒在4℃可存活1年，-20℃可长期保持感染性 病毒RNA有感染性。 手足口病的标本采集 （三）血清标本 采集急性期(发病0～5天)和恢复期(发病14～30天)双份配对血清用于抗体检测。检测IgM时，采集 (发病7～20天)血。静脉采集3～5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于－20℃以下冰箱中冷冻保存。 （四）咽拭子标本 采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（细胞维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 标本采集器械要求 注射器：医用（5ml和10ml）一次性注射器 棉拭子：塑料杆 全血收集管：10ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈) 血清保存管：2 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存） 粪便保存管：5-20 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）-全国POLIO网络实验室 标本采集器械要求 鼻咽拭子保存管：10 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存） 痰液保存管：50 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存） 尸检组织冻存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)；尸检（每一个样品换手术刀） 记号笔：油性，防水 标本采集注意事项 为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。 不能立即检测的标本应冷冻保存。 对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病2-4周后采集。 手足口病的实验室诊断方法 病毒分离 抗体检测 核酸检测 蛋白/核酸芯片 病毒分离培养 用于病毒分离的标本： 包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本 适用的细胞 RD细胞（人胚胎横纹肌肉瘤细胞）、Hep-2细胞（人喉上皮癌细胞） 病毒分离培养 标本的处理 1、粪便：2g 加PBS 10ml，振荡混匀，1500g低温离心20min，上清0.2ml接种敏感细胞 2、咽拭子：于采样管中充分洗涤拭子， 4℃下 10000rpm离心20min，上清0.2ml接种敏感细胞 3、脑脊液和疱疹液：直接接种 病毒分离培养 培养观察： 36℃培养逐日观察，第1代培养见可疑CPE 至观察满7天后再继续冻融传代，待稳定CPE出现后, - 20℃或- 70℃冻存以备进一步鉴定； 如果7天之后没有出现CPE，需盲传2代继续观察，盲传2代后仍不出现CPE则判定为阴性； 鉴定：中和试验 血清抗体检测 方法 中和实验、 ELISA IgM：单份血：急性期 IgG ：双份血：急性期，恢复期 阴