心肌SK2通道与RyR2相互作用的初步鉴定.pdfVIP

中文摘要 奠定坚实的理论基础，为临床心律失常药物作用的靶点提供新思路。 材料方法： 1．本实验采用成熟(16—22W)的C5781／6J小鼠，体重20—25 g，雌雄各半， 购买于上海实验动物中心。 2．抗体、试剂：兔源多克隆抗-SK2抗体(AlomoneLabs)，小鼠多克隆抗RyR2 抗体(Affinity Western Blot中抗体为TBST稀释，免疫化学荧光标记中抗体稀释为抗体稀 ml PBS，1BSA，0．05 G—Plus 释液100 g gNa2N3稀释。相关试剂有：protein Cruz agarose(Santa 试剂(USAThermo)．Cocktail蛋白酶抑制剂(RocheDiagnostics)． 3．Western Blot：分别分离C57BL／6J小鼠的心房及心室组织及大脑组织，以 组织裂解液裂解组织，提取目的蛋白。其中脑组织作为阳性对照。样品蛋白 羊抗小鼠IgG、HRP一山羊抗兔IgG，ECL化学发光，曝光显影检测目的蛋白。 mM 4．免疫共沉淀：小鼠心房肌组织中加入IP蛋白裂解液(50Tris-HCl，200 IllM mM X一100and mMNaCl，20NaF，1Na3V04，0．5％Tritoncompleteprotease inhibitor cocktail，pH7．4)，全细胞裂解液中分别加入小鼠单克隆抗RyR2 抗体和兔多克隆抗SK2抗体，阴性对照用小鼠源和兔源无关抗IgG抗体，4℃ 孵育过夜(大于12小时)，加入PrteinG—Sepharose4℃孵育6h。免疫复 合物经高盐、低盐、无盐IPbuffer洗兑后9000 rpm离心，取管底免疫复 合物，在免疫沉淀复合物中加入上样缓冲液，70℃煮样10min，用6％或 小鼠单克隆抗RyR2抗体进行WesternBlot检测。 5．免疫细胞化学：将小鼠心脏经主动脉根部逆行插管后置于Langendorff装置 、 上进行恒温恒速灌流，II型胶原酶消化分离小鼠心肌获得单个心肌细胞。4％ 多聚甲醛固定新鲜心肌细胞30min，0．3％TritonX-100穿膜lOmin，双重 中文摘要 兔IgG(1：100)室温孵育2hrs。荧光防淬灭剂封片，激光共聚焦显微镜 FVl000)观察SK2通道与RyR2的免疫阳性反应。 (Japan。Olympus 结果： 1．小鼠心肌组织中表达SK2通道和RyR2。 2．小鼠心肌组织中SK2通道和RyR2间能够相互形成免疫共沉淀复合物，提示 SK2通道与RyR2间存在相互作用。 3．小鼠心肌细胞上SK2通道与RyR2定位于细胞膜，RyR2沿T管膜分布，SK2 通道部分沿T管膜分布。 小结： 本研究初步证实了小鼠心房肌细胞天然表达的SK2通道和RyR2之间存在着 相互作用；并且在小鼠心房肌细胞T管膜上存在部分共定位。 关键词：SK2心肌细胞RyR2蛋白一蛋白相互作用小鼠 Abstract Interactionof SK2 Identify Channel Myocardium