一种高通量克隆方法与其在人类肝脏蛋白质组学上的应用.pdfVIP

引 言 随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究己进人了后基因组 时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构 基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序， 但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。由于蛋白质是生 物细胞赖以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者，基因的做作更多地 依靠基因的表达，表达产物的修饰和它们之间的相互作用来完成，蛋白质 是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的 研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。所以，蛋白质组学 的研究受到越来越多的关注0,21。 从基因组时代进入蛋白质组时代，是一个循序渐进的过程，也是必然 的过程，它反应了人类认识生命的过程。正是因为大量的基因组序列得到 破译，生物技术才能从单一化发展到规模化，才能真正地深入到基因的功 能，并进行高通量的研究。 克隆技术是生物研究最基础的技术，大规模基因的克隆的获得是进行 基因功能研究的基础，也是起始的重要环节，对于进一步进行蛋白质组学 研究具有重要意义。蛋白质组学的开展，要求建立起高通量的技术平台， 克隆的技术也必须实现高通量。 第一部分文献综述 1．1后基因组学研究概况 (Chromosome)的组合，用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念【3’ “．基因组研究可阻包含的内容为：(1)基因表达概况研究，即比较不同组织 和不同发育阶段、正常状态与疾病状态，以及体外培养的细胞中基因表达 模式的差异，技术包括传统的RT-PCR，RNase保护试验，m～印迹杂交等。 新的高通量表达分析方法包括微点阵，基因表达序列分析，基因芯片等； (2)基因产物蛋白质功能研究，包括单个基因的蛋白质体外表达方法，以 及蛋白质组研究；(3)蛋白质与蛋白质相互作用的研究，利用酵母双杂交系 统，单杂交系统以及反向杂交系统等。 基因组学(Oenomies)是1986年美国科学家ThomasRoderiek提出的[5】， 指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱)、核苷 酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门科学．所以基因组研究应包 括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学(Structural genomics)；fD以基因功能鉴定为目标的功能基因组学(FunctionalGenomics)， 后者又往往被称为后基因组学。 进入了后基因组学时代后，结构基因组学和功能基因组学的研究内容 得到了拓展，从原来小规模，单一的形式扩大成基因组学的整体大规模的 模式，在研究方法和技术上也发生了很大的转变，以适应新的研究要求。 后基因组研究涉及的主要内容及方法有： 1．】．1生物信息学(Bioinformatics) 随着人类基因组计划(HGP)在世界范围内的展开，产生了巨量的基 因信息，分析这些信息是人类基因组研究必不可少的内容。这也促成了生 物信息学的发展。生物信息学是用数理和信息科学的观点、理论和方法去 研究生命现象，组织和分析呈指数增长的生物学数据的--f]学科。研究DNA 2 和蛋白质，以计算机为主要工具，发展各种软件，把基因组DNA序列信息 分析作为源头，在获得蛋白质编码区的信息之后进行蛋白质空间结构的模 拟和预测，然后依据特定蛋白质功能进行必要的药物设计。故此，生物信 息学是由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成，对基因组信息学、 蛋白质结构模拟以及药物设计的研究为主要目的的学科。结构基因组学提 供了巨大的DNA和蛋白质数据，功能基因组学的一个任务就是如何充分利 用数据库去研究基因功能【6j。 生物信息学在后基因组学中的应用07]主要有： 1)新基因的发现与鉴定 使用基因组信息学的方法是发现新基因的重要手段，比如在啤酒酵母 完整基因组(约1200万bp)所包含的5932基因中，大约60％是通过信息分 析得到的。 (2)非编码区信息结构分析 虽然对约占人类基因组95％的非编码区的作用人们还不清楚，但从生 物进化的观点看来，这部分序列必定具有重要的生物功能。普遍的认识是， 它们与基因在四维时空的表达调控有关。应用生物信息学可以分类与确定 非编码区中各种组分、寻找新的非三联体的编码方式、研究编码区和非编 码区中信息调节规律等三个方面来揭示非编码区的秘密。 (3)对生