HPV疫苗产品工艺中切向流工艺应用模板.ppt

* * HEA的流穿模式：组装后料液混浊，常规“吸附-洗脱”模式较为困难。调整pH6-6.5，适度盐（如150mM）情况下，组装颗粒理论上应该快速流穿，而核酸，宿主蛋白等杂质大量被吸附。 * S buffer的pH是7.36，裂解液上清的buffer * * * * VLP的组装差异 Confidential 数量少，颗粒小 数量多，颗粒小 数量多，颗粒大 VLP的组装差异 Confidential 组装后区带下移 蔗糖密度 主题 HPV背景介绍 HPV工艺概览 Pall的应用方案 Confidential 常规工艺路线（酵母） 酵母培养 胞内表达 Confidential 收集酵母 离心机 澄清 离心机/超速离心机 颗粒解聚 解聚缓冲液 颗粒组装 超滤洗滤/浓缩 制剂 Al3+佐剂 裂解酵母 球磨机研磨 纯化1 疏水层析/离子交换 纯化2 超速离心/ 分子筛 针对酵母/细菌平台的应用点 Confidential 酵母培养 胞内表达 收集/洗涤酵母 中空纤维 30-50LMH 澄清 0.45μm 膜包 0.65μm HF 颗粒解聚 解聚缓冲液 颗粒组装 100KD 膜包 制剂 Al3+佐剂 裂解酵母 球磨机研磨 纯化1 S 纯化2 Mix mode 如纯化1 采用IEX，则该步骤采用流穿模式精纯 针对昆虫/真核细胞的应用点 Confidential 昆虫培养 胞内表达 澄清 深层滤板 颗粒解聚 解聚缓冲液 裂解细胞 反复冻融 纯化1 Q 颗粒组装 100KD 膜包 制剂 Al3+佐剂 纯化2 疏水 细胞澄清 HF 案例 酵母/细菌 浓缩/洗滤 HF 0.45 裂解液澄清 HF 0.65 Confidential 产品应用例1（酵母的收集洗滤） TMP=8-15psi, Flux35LMH 浓缩2.5倍（50%固含量），洗滤4倍 0.5N NaOH + 500ppm NaClO/ 1h Confidential 产品应用例2（细菌收获洗涤） TMP=5-9psi, VDF=5 FLUX=27LMH 0.5N NaOH + 500ppm NaClO/ 1h Confidential 产品应用例3（裂解液澄清） TMP=5-9psi, VDF=5 FLUX=23LMH 0.5N NaOH + 500ppm NaClO/ 1h Confidential 50NTU 产品应用例（裂解液澄清） 体系固含量( w/v) ELISA HPV含量 澄清工艺收率 酵母（3~5%） ~350-600ug/ml 65~80% 细菌（15~20%） ~150-350μg/ml 61~77% Confidential 产品应用例（酵母工艺参数细节） Confidential 样品名称 上清体积 折合菌体 ELISA含量 上柱前目的蛋白量 洗脱蛋白含量 柱洗脱总蛋白量 得率 破菌液 约1600ml 560g --- --- --- --- 100% 低速离心上清 1400ml 490g -- --- --- --- 87.5% 高速离心上清 约1000ml 117g 355.9ug/ml 360mg 150ml，1.8mg/ml(UV),1.88mg/ml(lowry) 282mg 100% 5倍体积洗滤后截留液 约1000ml 117g 5.3 ug/ml 5.3mg 50ml， 0.2mg/ml(UV),0.15mg/ml(lowry) 7.5mg 2.6% 0.65um中空纤维透过液 约5L，上样1.8L 1017.7ug/ml 5100mg 50ml, 1.2mg/ml(UV),1.33mg/ml(lowry) 185mg（1.8L折算至5L） 65.6% 应用点一：菌体收集 目的：收集菌体，并置换为裂解液，脱除杂质及培养副产物 采用750KD，1.0mm内径的中空纤维，低于1倍浓缩（固含量从30%提高到50%），然后4倍洗滤，均通量为65LMH 左右。 如发酵液体积为100L，需要在2小时内处理完， 则总处理体积 V=100-(100*0.6)+(100*0.6)*4=280L 每小时处理量=280/2=140L 所需膜面积S=140/65=2.2平米 推荐仕必纯向 K06-E750-10-N，单支膜面积 2.55㎡, 仕必纯公司可根据具体要求设计定制化的不锈钢系统 应用点二：裂解液澄清 目的：去除细胞碎片，并收集目的蛋白（抗原） 采用孔径为0.65um或者0.45um，1.0mm内径的中空纤维，5倍洗滤，均通量为30LMH 左右。 如发酵液体积为100L，需要在2小时内处理完， 则总处理体积 V=100*5=500L，每小时处理量=500/2=250L 所需膜面积S=250/30=8平米