课件：组织化学技术免疫组化.ppt

现在还有plus盒。优点是：更简便，放大倍数↑，等电点中性更适合组织。分子量小，穿透力↑，原理保密。 7．蛋白A—金法（Protein—A gold method） ~多用于电镜 8．双重组化染色法 应用双重免疫组织化学激素可在同一张切 片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不 同的抗原。 9．免疫金—银染色法 （Immunogold—silver staining IGSS） （二）固定——见前述 注意事项： 1．固定剂的选择：因组织而不同，注意质量和 性能。 2．固定方式的选择：① 浸渍固定（参考文献） ② 灌注固定（+后固定） ③ 蒸汽固定 （三）免疫组化染色步骤（以ABC法为例） 1．切片脱蜡入水，入PAS 洗三次/15分钟。 2．封闭内源性过氧化物酶。 用新配置的0.3％H2O2 （在PAS或0.05Tris— HCL缓冲液PH7.6中或甲醇中）室温，30 分 钟。 3．水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。 4．减少非特异性着色 用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物 血清！），室温，30分钟。 5．滴加第一抗体，4℃过液或室温5′~1 hour。 6．0.1MPBS，洗三次，每次5分钟。 7．滴加第二抗体，室温15′~ 60′。 8．0.1MPBS 洗净，洗三次，每次5分钟。 9．滴加ABC复合物，室温15~60分钟。 10．0.1MPBS 洗三次，每次5分钟。 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 11．0.05M Tris –HCL 5~10分钟，此步可省略。 12．DAB—H2O2 显色：用0.01％H2O2的DAB溶 液，室温5~30分钟，随时镜检（DAB用时 新配） 13．自来水洗净。 14．用Mayer 苏木精或0.5％甲基绿，复染胞 核（可不染）。 15．常规脱水、透明、封固、镜检。 结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。 （四）免疫组化染色基本技术及注意事项 1．实验计划 ① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。 如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则 不能用其他动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若 PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。 ② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差 异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否 则无可比性。 ③ 选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。 2．Ab稀释度 （如系购买的药盒有工作液和原液） （1）工作液：无须稀释 （2）原液： ① 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。 如：工作液浓度为1∶1000， 可选1∶500 1∶1000，1∶1500试验； 若: 1∶500有背景，1∶1000阳性反应稍 浅，可选1∶750进行试验。 原液的保存（—20℃）冻存——应选最佳稀 度冻存。 ③ 若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释 十倍，而后分装10μl/瓶→冻存（-20 ℃） 于 冰箱备用。 ④ 关于Ab保存应参照说明书。 （3）Ab浓度的选择 Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少；极过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。——并非Ab浓度越高越好。 3．Ab滴片技术 —— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。 ［注意］ 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能 干片。 要领：甩净组织周围的水。 4．PBS洗涤技术 （1）洗涤的目的 ① 保证离子浓度和PH值。 ② 减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯） Ab滴片图示： （2）方法：洗三次，每次5分钟。 5．Ab孵育技术 （1）必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。 （2）温度与时间 4℃：过液， ＞16 37℃：1 h or 参考说明书 6．光镜控制显色方法 （1）室内操作：注意温度与时间的关系，室温 最宜5分钟。 （2）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可 加深。 （五）对照组和染色结果的评价 免疫组化染色实验组与对照组结果分