课件：细胞培养常用技术.ppt

多聚螯合物法，应用了酶标聚合物技术，如EnVison检测系统，采用了辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记在葡萄糖聚合物上，再与二抗连接，形成EnVison二抗；象PowerVision检测系统，采用了辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记在氨基酸片段上。由于聚合物上超过20个以上的位点能与一抗结合，聚合物上的酶数量也较多，故较ABC、LSAB等方法更为敏感。最为重要的是，由于LDP系统二抗上没有生物素的存在，不会出现ABC、S-P等方法中出现的与内源性生物素结合的交叉反应，减少了非特异性着色，背景更为干净。 双重染色法 1、固定细胞。 2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30% H2O2)室温 20分钟。 水洗。 3、抗原修复（选择采用）。 4、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。 5、滴加正常血清37 ℃，30分钟。（可不用） 6、甩去多余血清，加一抗37 ℃，30分钟。 7、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。 8、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分钟。 9、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。 10、滴加ABC复合物（辣根过氧化物酶），37 ℃，45分钟。 11、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。 12、DAB（棕色）或AEC（红色）显色3～10分钟。 13、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。 14、滴加正常血清37 ℃，30分钟。（可不用） 15、甩去多余血清，加第二种一抗37 ℃，30分钟。 16、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。 17、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分钟。 18、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。 19、滴加碱性磷酸酶复合物，37 ℃，30分钟。 20、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。 21、BCIP/NBT显色（蓝色） 22、水洗。 23、甲基绿复染，脱水，透明，封固。 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 * 样品中的不同成分对某种化学试剂有不同的亲和性，如锇酸染脂肪；铅盐染蛋白质；醋酸铀染核酸等。 电镜样品仅用重金属盐进行染色以形成明暗反差，只能观察到黑白图象。它不能像光镜切片染色那样通过改变波长而获得彩色图象。 * 隧道效应：通常在低压下，两个电极之间具有很大的阻抗，阻止电流通过，称之为势叠。当二电极近到一定距离时(100nm)，电极之间产生了电流，称隧道电流。这种现象称隧道效应。 1982年，国际商业机器公司苏黎世实验室的葛.宾尼博士和海.罗雷尔博士及其同事们共同研制成功了世界第一台新型的表面分析仪器——扫描隧道显微镜(STM)。它的出现，使人类第一次能够实时地观察单个原子物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物理、化学性质，被国际公认为80年代世界十大科技成就之一。为此，1986年，宾尼博士和罗雷尔与发明电子显微镜的鲁斯卡获诺贝尔物理学奖。 * 隧道效应：通常在低压下，两个电极之间具有很大的阻抗，阻止电流通过，称之为势叠。当二电极近到一定距离时(100nm)，电极之间产生了电流，称隧道电流。这种现象称隧道效应。 1982年，国际商业机器公司苏黎世实验室的葛.宾尼博士和海.罗雷尔博士及其同事们共同研制成功了世界第一台新型的表面分析仪器——扫描隧道显微镜(STM)。它的出现，使人类第一次能够实时地观察单个原子物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物理、化学性质，被国际公认为80年代世界十大科技成就之一。为此，1986年，宾尼博士和罗雷尔与发明电子显微镜的鲁斯卡获诺贝尔物理学奖。 * 技术参数： 分辨率： X-Y向0.1nm（原子级分辨率） 样品尺寸：≤Φ45mm 样品厚度：≤25mm 扫描范围：标准配置1μm×1μm；30μm×30μm；高达100um X 100um的大范围扫描器（选件） 图像采样点：512×512 最大扫描速率：55000 P/S 进样方式：步进马达控制自动逼近，行程≤30mm，精度≤83nm 扫描控制：双16-bit D/A（相当于26位精度） 数据采样：双16-bit A/D （相当于23位精度） 过碘酸席夫反应法（periodic acid Schiff reaction，PAS） 原理：过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖的乙二醇基（CHOH-CHOH）氧化成两个游离的醛基，它们与Schiff试剂反应生成紫红色产物。 细胞内糖类的染色方法 试剂配制： 染色过程： 染色结果：细胞含糖原区呈紫红色。 细胞内脂类的染色方法 苏丹（Sudan）Ⅲ/Ⅳ法 苏丹黑法 Lillie油红O（oil red O）法 Cain硫酸尼罗蓝（Nile）法