生物化学2 3 氨基酸和蛋白质一级结构.ppt

现代生物学研究的热点 Gene(DNA) : Genome Genomics Transcript(RNA): Transcriptome Transcriptomics Protein: Proteome Proteomics Metabolism: Metabolome Metabolomics -ome 组 -omics 组学 2、根据溶解度分 等电点沉淀 盐析（常用硫酸铵） 有机溶剂沉淀 3、根据电离性质分 电泳 离子交换层析 1、根据分子大小分 透析或超滤 离心沉淀 凝胶过滤层析 蛋白质性质及分离纯化的方法小结 4、特异亲和力： 亲和层析 本章小结： 氨基酸结构 1. 结构通式：不同AA在于R不同 2. 立体异构体：D-/L- 3. 分类 ： 按酸碱、极性、营养成分 4. 不常见氨基酸 氨基酸性质 1. 紫外吸收 2. 两性性质：等电点 3. 重要化学反应 蛋白质一级结构 蛋白质纯化与分析 * * * * * * * * * * * * * * * * * * 在蛋白质的一级结构中，参与功能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基，即使在整个分子中发生一个残基的异常，那么该蛋白质的功能也会受到明显的影响。被称之为“分子病”的镰刀状红细胞性贫血仅仅是574个氨基酸残基中，一个氨基酸残基即β亚基N端的第6号氨基酸残基发生了变异所造成的，这种变异来源于基因上遗传信息的突变。 574 * 羧基：c-末端的α-羧基，β-羧基（Asp），γ-羧基（Glu）。 氨基：N-末端的α-氨基，Lys-氨基，Arg-胍基，His-咪唑基 Cys-SH， Tyr-酚羟基 * * 每克蛋白能吸附0.3-0.5g的水 * 生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。 * * * 凝胶的浓度和孔径可调节。 * * 阳离子交换层析原理 洗脱方法：改变盐浓度和改变pH的方法 阴离子交换层析分离蛋白质 交联葡聚糖离子交换剂 利用生物分子与配体之间所具有的专一而又可逆的亲和作用，使生物分子分离纯化的技术 这种分离纯化方法专一性强，理论上可以从复杂的体系中一步提取所需的物质。 亲和层析 (affinity chromatography) 酶与底物、抑制剂、效应物及其结构类似物 激素与受体蛋白 抗原与抗体 生物素与亲和素（抗亲和素蛋白） 糖与凝集素等 免疫亲和层析：抗原—抗体 凝集素亲和层析：糖—凝集素 金属螯和层析：如NTA-Ni—poly-His 免疫亲和层析（/web/page/news4691.htm 金属螯和层 析（/bio101/2006/8161.htm） 吸附法是利用各种吸附剂和蛋白质结合能力（吸附能力）的不同来分离蛋白质。 极性：硅胶、氧化铝（离子吸引和氢键） 最广泛最有效：羟基磷灰石（hydroxyapatite)，即结晶磷酸钙[Ca10(PO4)6(OH)2]，与DNA的亲和力最高，可分离蛋白质、核酸 非极性：苯基琼脂糖、辛基琼脂糖（范德华力、疏水作用） 吸附层析 疏水作用层析和反相HPLC 疏水层析和反相HPLC 1 原理：利用蛋白质疏水性的差异进行分离。 2 介质： HPLC： 苯基：分离蛋白质 C18：分离肽段 常压介质： 疏水性由弱到强：丙烷基 戊烷基 苯基 辛烷基 HPLC的原理与常规的层析原理是一样的，只不过它所使用的基质颗粒更小，基质填充比常规下的层析柱更致密。 HPLC中，由计算机控制的泵将蛋白质样品和洗脱液输送至层析柱，层析柱是由不锈钢制造的，每平方英寸可以承受几百磅的压力。计算机控制样品和溶剂的流速，可任意地选择洗脱条件，以保证高重复性。 利用高压液相层析可以大大提高速度、分辨率和灵敏度。 高压液相色谱是一种多用途的层析方法，可以根据特定类型分子的大小、极性等的不同将其分离开来。 高压液相色谱层析（HPLC） 泵的结构 层析系统 层析系统主要由泵、色谱柱、检测器等组成 HPLC层析系统 凝胶电泳（gel electrophoresis） 电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。根据蛋白质分子大小和所带净电荷