重组体在原核细胞中表达和调控.pptVIP

重组体在原核细胞中表达与调控 基因表达概述 基因表达：指基因携带的遗传信息，经过转录、翻译、加工修饰等复杂的生化反应，产生具有生物学功能的蛋白质过程，即DNA→RNA→蛋白质. 基因表达调控 转录水平调控 转录产物加工 mRNA从核到细胞质 mRNA降解 翻译水平 原核与真核生物基因组比较 真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量级 真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分（如线粒体DNA等），这就增加了基因表达调控的层次和复杂性 细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽链形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多 原核基因组的大部分序列都为编码基因，哺乳类基因组的中仅约10%的序列是编码蛋白质或rRNA、tRNA等的基因，其余约90%的序列功能至今还不清楚 原核生物基因的蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子和内含子，在转录后经剪接去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节 原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列。绝大多数真核生物的蛋白质编码的基因在单倍体基因组中都不重复，是单拷贝的基因 原核基因转录特点 原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有3种），识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成 原核生物无核膜，所以转录与翻译是耦联的；形成多核糖体，可在一条mRNA链上同时合成多条肽链，效率高 mRNA可从两条链中任一条有意链上转录，转录方向与DNA方向相反（3’ →5 ’ ），并且在mRNA还没有合成完时，翻译就开始 基因表达调控在转录水平，两种方式：起始控制（启动子），终止控制（衰减子） 原核具有SD序列，即同16S核糖体RNA 3’末端碱基互补的序列 操纵子结构 外源基因在原核表达的条件 通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白 外源基因不能带有间隔序列（内含子），如cDNA或全合成的基因 利用原核强启动子及其两侧的调控 SD序列与起始子密码子ATG有合适的距离 外源基因下游加上不依赖ρ因子的转录终止区 正确的开放读码框架 利用宿主调控系统，调节外源基因表达，防止产物毒害宿主 外源基因在原核表达调控元件 启动子：能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列 Pribnow box：-10区；TATAAT（与RNA聚合酶核心酶结合，解旋DNA，合成RNA） -35区：TTGACA（与σ因子结合） 代表强启动子：乳糖启动子（Lac）；色氨酸启动子（Trp）；噬菌体左向启动子（λPL）；Trp-Lac杂合启动子（Tac）；T7噬菌体启动子 乳糖操纵元 凡能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的序列，不论其对基因转录的作用是减弱、阻止或增强、开放，都可称为操纵子。 乳糖操纵元：转录负调控 基因：操纵基因（O）；启动子（P）；3个结构基因（Z、Y、A） 诱导剂：IPTG 乳糖操纵元基因图和表达调控 色氨酸操纵元 色氨酸是构成蛋白质的组分，一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸，细菌要生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸，但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负担。细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵元（trp operon）的调控。 两种调控方式 阻遏蛋白的负调控 阻遏蛋白+色氨酸→有活性的阻遏蛋白+操纵基因→无活性的操纵基因 衰减子 依赖与色氨酸浓度或其他氨基酸浓度 诱导物：β-吲哚丙烯酸 PL和PR启动子 λ噬菌体CI基因负调控 温度敏感的启动子：32℃→42℃ 原理：在42℃时，CI蛋白失活 工作方式 宿主合成CI蛋白 载体编码CI蛋白 核糖体结合位点（SD序列） 在mRNA分子中起始密码子AUG上游8-13bp处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，由3-9bp组成，它可以与30S亚基中的16S rRNA 3端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，因此有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始。上述mRNA分子的序列特征1974年由J.Shine和L.Dalgarno发现，故称为SD顺序。 大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3-端的互补性 终止子 终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号