二价金属离子锌对mes23.5多巴胺能细胞的损伤作用及开可能机制的研究.docxVIP

二价金属离子锌对MES23．5多巴胺能细胞的损伤作用及可能机制的 二价金属离子锌对MES23．5多巴胺能细胞的损伤作用及可能机制的 研究 摘 要 帕金森病(Parkinson’S disease，PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病， 以肌强直、肢体震颤和运动减少等症状为主要临床表现。PD病理特征主要是中 脑黑质致密带(substantia nigra pars compact,SNpc)多巴胺(dopamine,DA)能 神经元缺失。PD的病因至今未完全明了，可能有多种因素参与，如遗传因素、 环境因素、氧化应激、炎症反应和神经营养因子缺失等。随着生活水平的提高， 环境因素在PD中的作用也日益引起人们的重视。在诸多的环境因素中，业已证 实金属离子能促进黑质多巴胺能神经元的死亡。神经化学、临床以及流行病学方 面的研究都提示长期接触锌等二价金属离子可能参与PD的发病。 临床尸检证明二价金属离子锌在PD病人的黑质(substantia nigra，SN)区含 量增高50—54％，而在6一羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6--OHDA)制各的 PD模型大鼠SN区经质谱分析技术检测锌离子的含量也有明显增高，这就提示 SN内的高锌离子可能与PD的发病之间存在某种联系。最近的实验证实向大鼠 SN内注射ZnCl2可以导致DA能神经元凋亡，说明SN内的高锌离子可能是通过 诱导DA能神经元凋亡从而参与PD的发病。但是到目前为止，锌离子诱导凋亡 的具体机制还不清楚。为研究锌离子对DA能神经元的损伤作用及探讨其引起神 经元凋亡的可能机制，本实验选择了MES23．5DA能细胞系作为研究对象。首先 应用MTT法评价不同浓度锌离子对细胞存活率的影响并利用Hoechst 33258染 色观察细胞核的凋亡改变，以证实锌离子是否能诱导细胞凋亡；为了检验锌离子 是否影响细胞的功能，采用蛋白免疫印迹技术(western blots)及半定量逆转录 聚合酶链反应(semi．quantitive reverse transcription polymerase chain reaction。 RT-PCR)检测锌离子对酪氨酸羟化酶(tyrosine hydro举lase，TH)蛋白及mRNA 表达的影响，并利用高效液相色谱电化学检测法(1li曲performance liquid chromatography-electrochemical detection,HPLC．ECD)观察了锌离子对细胞中DA 含量的影响；为了进一步探讨锌离子引起细胞凋亡的可能的机制，我们采用全细 胞膜片钳技术记录细胞膜上电压依赖型延迟整流性钾通道电流，观察锌离子对钾 通道电流密度的影响，并观察钾通道电流的改变与细胞凋亡之间是否存在时间相 关性；利用RT-PCR检测锌离子对细胞内Bcl．2、Bax mRNA表达的影响；利用 流式细胞仪检测线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential，AWm) 及caspase．3活性的变化；最后应用钾通道阻断剂四氯季胺(TEA)观察阻断钾 通道电流后是否能抑制细胞凋亡的发生。结果如下： 1．不同剂量的锌离子处理MES23．5细胞24 1．不同剂量的锌离子处理MES23．5细胞24 h后，细胞存活率发生改变。较高剂 量的锌离子(70，80，90 I．unol／L)造成细胞存活率明显降低(PO．01)；低剂量 的锌离子(30，40，50 I-tmol／L)对细胞存活率没有影响(po．05)。60 I-tmol／L锌 离子可以降低细胞存活率但不具有统计学意义。 2．不同剂量的锌离子处理MES23．5细胞24 h后，细胞出现不同程度的凋亡改变。 60 l-Irnol／L和90 lanol／L的锌离子可以造成明显的细胞凋亡，胞体变圆，细胞核 固缩，染色质凝集，凋亡细胞比例分别为13．38+0．6％和22．66+1．1％(P0．01)。 30 gmoFL锌离子处理组与正常对照组相比差别不具有统计学意义(PO．0S)。 3．60 jnnol／L锌离子处理MES23．5细胞24 h后，细胞内TH蛋白表达量较正常 对照组明显降低(尸O．01)；TH mRNA表达量变化与蛋白表达量变化一致，较 正常对照组明显降低(po．01)；同时细胞内DA的含量也低于正常对照组 (PO．05)。 4．MES23．5细胞表达TEA敏感的电压依赖型延迟整流性钾通道电流。锌离子对 钾通道电流密度的增强具有时间依赖性。锌离子作用1．2 h对钾通道电流密度没 有影响(p加．05)，4 h即引起钾通道电流密度明显增高，至8 h达到高峰，16 h 时有所降低(PO．01)。并且应用20mmoFL TEA可以完全拮抗锌离子增强的