东方巴贝斯虫顶质体基因组的测序分析及ron2在入侵中作用的研究-预防兽医学上专业毕业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文2．4讨论 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 2．4讨论 ．．：!zI 第三章东方巴贝斯虫RON2在入侵中作用的研究 ．26 3．1研究目的与意义 26 3．2材料与方法 26 3．2．1菌株、血清、载体及蛋白 ．26 3．2-2主要仪器与试剂 ．．27 3．2．3主要溶液的配制 28 3．2．4水牛红细胞膜蛋白的获取 30 3，2．6东方巴贝斯虫裂殖子全抗原的提取 30 3．2．5棒状体颈部蛋白RON2基因的克隆与测序 30 3．2．7 RON2重组表达质粒的构建 ．3l 3．2．8 RON2重组蛋白的原核表达 ．3 1 3．2．9 RON2重组蛋白的纯化提取 ．31 3．2．10 Far-western Noting 32 3．2．11 AMAl多克隆抗体血清IgG的纯化 32 3．2．12生物素标记AMAl多克隆抗体血清IgG的试验 33 3．2．13 AMA与IⅧN2的粘附ELISA试验 34 3．3结果与分析 ．35 3．3。1 BoRON2基因的序列扩增及测定 ．35 3．3．2 BoRON2基因序列的生物信息学分析 ．37 3．3．3 RON2短肽段原核表达质粒的构建 ．38 3．3．4短肽段重组蛋白的诱导表达 39 3．3．5重组蛋白的纯化 ．40 3．3。6 Far-western结果 ．41 3．3．7顶膜抗原AMAl多抗血清IgG的纯化及生物素标记 ．．43 3．3．8 AMAl多抗血清标记生物素后IgG效价的测定 ．44 3．3．9 AMAl与RON2粘附ELISA试验 44 3．4讨{仓 ．．46 3．4。l棒状体颈部蛋白RON2的基因克隆与截短表达 46 3．4．2 RoN2与AMAl蛋白相互作用的验证 46 4结论 ．．48 参考文献 ．49 致谢 59 附勇毛 6l II 万方数据 东方巴贝斯虫顶质体基因组的测序分析及RON2在入侵中作用的研究摘要 东方巴贝斯虫顶质体基因组的测序分析及RON2在入侵中作用的研究 摘要 东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是牛的巴贝斯虫病中比较特殊的一个血液原虫 虫种，其仅感染水牛的红细胞，由镰形扇头蜱经卵传播。在我国长江以南多省份均 有流行，患病动物常出现黄疸、高热、贫血和血红蛋白尿等症状，严重时甚至死亡， 对我国的水牛养殖业造成巨大的经济损失。现阶段对于东方巴贝斯虫的基因组信息 所知有限，入侵相关机制的研究也鲜有报道。 基于此，本研究一方面克隆并注释了东方巴贝斯虫的顶质体基因组DNA序列， 并对其总体的结构特征进行了详细的比对分析：另一方面，钓取了东方巴贝斯虫棒 状体颈部蛋白2(RON2)基因信息，对RoN2与AMAl的相互作用进行了初步研 究。 (1)B．orientalis顶质体基因组的测序分析 对于顶质体基因组，根据基因组测序的高通量测序序列和eDNA文库钓取的部 分顶质体DNA序列，结合NCBI公布的顶复门血液原虫项质体DNA序列，选择其 保守区设计引物，克隆东方巴贝斯虫项质体DNA全长。测序结果用软件进行拼接， Artemis做注释。结果表明，东方巴贝斯虫项质体基因组全长33200bp的环状分子， AT含量在78．9％，包含1个核糖体大亚基(LSU)、1个核糖体小亚基(SSU)，38 个编码蛋白的开放读码框以及24个转运RNA(tRNA)。其中38个ORF包括4个 DNA依赖的RNA合成酶小亚基(rpoB、rpoCl、rpoC2a、rpoC2b)、17个核糖体蛋 白、1个翻译延长因子(tufA)、2个Clp分子伴侣基因以及14个大小功能未知的假 定蛋白。进一步对所获得的东方巴贝斯虫项质体基因组DNA与NCBI上有报道的相 关顶复门寄生虫作了详细的比对分析，综合的结果表明东方巴贝斯虫顶质体基因组 从基因组大小，基因种类，基因结构，基因排列顺序，基因进化分析等一系列特征 上都与牛巴贝斯虫的顶质体最为接近。 (2)棒状体颈部蛋白RON2和AMAl基因的相互作用 根据NCBI上公布的顶复门寄生虫的RON2序列及部分假定蛋白序列和东方巴 贝斯虫基因组测序获得的部分序列，设计引物克隆东方巴贝斯虫棒状体颈部蛋白2 (RON2)基因，获得的测序结果全长为4035bp，本研究选取了RON2与AMAl有 相互作用的功能域进行截短表达，分别设计特异性引物克隆BORON2．2、BORON2．5， 构建GST标签原核表达质粒pGEX．KG．RON2．2、pGEX．KG．RON2．5，高效表达。 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文用纯化后的RON2．2、RON2．5重组蛋白进行Far．western实验，以及和AMAl蛋白 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 用纯化后的RON2．2、RON