钙调磷酸酶调节蛋白音1rcan1与nfκb相互作用机制及其影响白血病细胞活力的研究.docx

. . 原创性声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 鲤邀数 日 期：If_!!，_迦 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：苤阻邀导师签名：。丕鱼焦』笙日 期：丝¨二兰兰! 山东大学硕士学位论文目 山东大学硕士学位论文 目 录 目录 i TABLE OF CONTENTS ．iv 中文摘要 ．诚 Abstract ．ix 符号说明 ．．】【i 第一章前言 1 1．1．核转录因子NF．1cB ．1 1．1．1．核转录因子NF．r,B的组成和功能 ．1 1．1．2．核转录因子NF．KB的激活 ．1 1．1．3．核转录因子NF．r,B的调节 ．．3 1．1．4．NF．r,B的生物功能作用 4 1．1．4．1．NF．KB与细胞凋亡 。4 1．1．4．2．NF．r,B和免疫应答作用 5 1．1．4．3．NF．r,B和肿瘤 ．5 1．2．RCANl基因 ．6 1．2．1．RCANI的发现 。6 1．2．2．RCANl的基因家族 7 1．2．3．RCANI在细胞内的功能 7 1．2．3．1．RCANl对Calcinemin的双重调节作用 7 1．2．3．2．RCANl与SODl的调控 ．9 1．2．3．3．RCANI与NF．r,B信号通路 ．9 1．2．4．RCANl与疾病 一9 1．2．4．1．RCANl与氧化应激 ．9 1．2．4．2．RCANl与神经元凋亡 10 1．2．4．3．RCANl与心肌肥大 10 1．2．4．4．RCANl与血管发生 10 1．2．4．5．RCANl和DS ．1l 1．2．4．6．RCANl与AD ．1 1 i 山东大学硕士学位论文1．2．4．7．RCANl与肿瘤 山东大学硕士学位论文 1．2．4．7．RCANl与肿瘤 12 第二章材料与方法 13 2．1．质粒的构建 13 2．1．1．RCANl启动子质粒的构建 ．13 2．1．2．RCANl-NF．KB质粒的构建 14 2．1．3．定点突变RCANl启动子质粒的构建 15 2．1．4．病毒质粒构建 ．15 2．2．细胞培养 。16 2．2．1．细胞培养基的制备 16 2．2．2．细胞的消化 ．16 2．3．细胞转染 16 2．4．双荧光素酶活性检测 17 2．5．反转录PCR(Reverse Transcription．Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)一1 8 2．5．1．细胞的制备 ．18 2．5．2．RNA的提取 l 8 2．5．3．cDNA的合成 ．1 8 2．5．4．半定量．PCR(Semi．Quantifieation-PCR) 一19 2．5．5．实时定量．PCR(Real time Quantification．PCR) 19 2．6．Western Blotting 19 2．7．免疫共沉淀(CO．口) 20 2．8．腺病毒的包装和感染 21 2．9．细胞活力检测 21 2．10．细胞凋亡的检测 2l 2．11．核蛋白的提取和EMSA实验 2l 2．11．1．核蛋白的提取 ．．2l 2．1 1．2．EMSA实验 22 2．12．原代细胞的分离 23 第三章实验结果 24 3．1．RCANl抑制NFrB的活性 24 3．1．1．RCANl抑制NF．KB的荧光素酶活性 24 ii 山东大学硕士学位论文3．1．2．RCAN 山东大学硕士学位论文 3．1．2．RCAN I抑制NF．KB入核 ．．25 3．1．3．RCANl抑制NF．r,B结合活性 。26 3．2．RCANl能增加Ir,Ba的稳定性并与其具有蛋白间的相互作用 27 3．2．1．RCANl的增加了Ir,Ba的稳定性 27 3．2．2．RCANl的敲除促进IKBa第42位的络氨酸残基磷酸化 。27 3．2．3．RCANl与Ir,．Ba具有相互作用 29 3．3．RCANl的诱导了急性白血病细胞系和原代急性白血病细胞的凋亡 ．29 3．3．1．RCANl抑制了急性白血病细胞系中NF．1cB的活性 ．29 3．3．2．RCANl降低了急性白血病细胞系的活力 ．．30 3．3．3．RCANl降