猪圆环病毒研究概况演示文稿.ppt

猪圆环病毒研究概况 1、猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）概况 2、PCV复合PCR方法的建立及初步应用 3、PCV2毒株的分离及鉴定 4、PCV2全基因组的克隆及序列分析 5、PCV2分子克隆化病毒的构建 6、PCV2主要结构蛋白基因（ORF2）的克隆与真核表达 7、PCV2单克隆抗体的研制 猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）与鸡贫血病毒（CAV）、鹦鹉喙羽病病毒（PBFDV）和一些植物病毒同属于圆环病毒科（Circoviridae）成员，为单股负链环状DNA病毒，直径15-17nm，为已知最小的动物病毒之一。PCV与同病毒科的CAV和PBFDV没有任何抗原交叉性及基因序列同源性。 一、猪圆环病毒概况 PCV基因组结构 PCV-1、2基本情况 1、PCV-1基因组全长1，759bp，PCV-2为1，768bp；基因组核苷酸序列同源性仅为68%-75%。 2、PCV-1、2都主要包含ORF1、ORF2两个阅读框；ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白；ORF2编码病毒的核衣壳蛋白，具有良好的免疫原性。 3、PCV-1无致病性，广泛存在于猪源细胞及正常猪体内各组织中；PCV-2现证明与断奶仔猪多系统消耗综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）及A2型先天性综合征相关。 PCV致病性及危害 1、PCV可在猪源细胞培养物上繁殖，不产生CPE，易被忽视，因此对猪源细胞疫苗或诊断抗原生产造成潜在的危害。 2、PCV-2多数情况下引起亚临床感染，但如与其他病原如PPV等混合感染或环境应激情况下则可直接发生PMWS。 3、PCV-2的靶细胞 为淋巴细胞，主要是B细胞，病毒感染后引起细胞凋亡，使机体免疫抵抗力下降，从而继发感染其他病原体，包括PRRSV、猪链球菌等，引起更严重的疾病。 研究目的 1、建立一套完整的便于实际推广应用的检测PCV感染的方法，如PCR、IFA及ELISA方法等。 2、用建立的方法对我国主要养猪省份进行PCV的流行病学调查，以便提出有效的综合防治措施； 二、复合PCR方法的建立 1、引物设计 引物1（为PCV-1、2共同序列）： 5’-CCGCGGTGGCTGAACTT-3’（PCV-1 nt478-496；PCV-2 nt491-519）； 引物2（PCV-1特异序列）： 5’-CTCGGCTATGCGCTCCAAAATG-3’（PCV-1 nt1108-1129）； 引物3（PCV-2特异序列）： 5’-ACCCCCGCCACCGTTACC-3’（PCV-2 nt1627-1644） 引物1、2扩增的片段长度为652bp，引物1、3之间的跨幅为1154bp。 M 1 2 3 M M：DNA分子量标准 DL-2000 1：接种阳性PCV-1、2毒株的PK-15； 2：接种阳性PCV-2毒株的PK-15； 3：未接种病毒的PK-15。 2000bp 1000bp 750bp 500bp 2、复合PCR方法的初步应用 1）对多株猪源传代细胞（包括4株PK-15及1株ST细胞）进行了PCV检测，发现所有细胞均污染有PCV-1，其中一株还扩增出了PCV-2基因片段； M：DNA分子量标准 DL-2000 1：PK-15（a） 2：PK-15（b） 3：PK-15(c) 4：PK-15(d) 5：ST 1 2 3 4 5 M 2000bp 1000bp 750bp 500bp 2）对38个病例（病猪表现为消瘦、呼吸困难及淋巴结肿大等）的组织（取肺）进行PCR扩增。结果发现，9个病例同时存在PCV两种血清型病毒感染，23个病例感染有PCV-2 。部分电泳结果见下图。 1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 14 M 图中样品1、3、4、6、12、14扩增出了PCV-2核酸片段；8、9及11含有两种PCV的核酸；其余样品为阴性。 三、PCV-2毒株的分离鉴定 病料处理（将PCR扩增阳性的组织病料用氯仿抽提去除有曩膜的病毒，如PRRSV） 接种细胞—PK-15盲传10代（300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理） 间接免疫荧光实验及电镜观察病毒颗粒 接种病料的PK-15的IIF结果 未接种病料的PK-15的IIF结果 超薄切片观察结果（30，000×） 本实验室共分离鉴定了5株PCV-2，根据其分离地将其分别命名为Shanghai PCV、Jiangsu PCV