常用方法介绍BMB171毒力的生物测定SEM观察生物膜和沉降课件.ppt

常用方法介绍BMB171毒力的生物测定SEM观察生物膜和沉降 苏云金芽胞杆菌 苏云金芽胞杆菌，简称Bt,是包含一类产杀虫晶体蛋白（ICPs）的芽胞杆菌。该菌可产生两大类毒素，即胞内毒素（伴胞晶体）和胞外毒素，使害虫出现进食困难，最终死亡。因此苏云金芽胞杆菌可用作微生物源低毒杀虫剂，用于防治直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目，特别是鳞翅目的多种害虫。 苏云金芽胞杆菌毒力测定 秀丽隐杆线虫（小杆线虫目） 1 甜菜夜蛾（鳞翅目） 2 家蚕（鳞翅目） 3 棉铃虫（鳞翅目） 4 Helicoverpa armigera Hubner 棉铃虫，Helicoverpa armigera Hubner，鳞翅目，夜蛾科，属昆虫的一种，是棉花蕾铃期的主要害虫。 广泛分布在中国及世界各地，中国棉区和蔬菜种植区均有发生。黄河流域棉区、长江流域棉区受害较重。近年来，新疆棉区也时有发生。该虫是中国棉区蕾铃期害虫的优势种，近年为害十分猖獗。 寄主植物有20多科200余种。棉铃虫是棉花蕾铃期重要钻蛀性害虫，主要蛀食蕾、花、铃，也取食嫩叶。 Helicoverpa armigera Hubner 成虫 卵 蛹 幼虫 一龄 二龄 三龄 四龄 五龄 六龄 幼虫体色多变 体色淡红 体色黄白 体色淡绿 体色黑褐 Helicoverpa armigera Hubner 老熟幼虫体长30～42 mm，体色变化很大，由淡绿、淡红至黑褐色。 棉铃虫生活习性与繁殖 成虫白天隐藏在叶背等处，黄昏开始活动，取食花蜜，有趋光性。卵散产在寄主嫩叶、果柄等处，每雌一般产卵900多粒，最多可达5000余粒。 幼虫5～6龄。初孵幼虫当天栖息在叶背不食不动，第2天转移到生长点，但危害还不明显，第3天变为2龄，开始蛀食花朵、嫩枝、嫩蕾、果实，可转株为害，每幼虫可钻蛀3～5个果实。4龄以后是暴食阶段。老熟幼虫入土5～15厘米深处作土室化蛹，以蛹越冬。 棉铃虫的室内饲养 在传统人工饲料饲养技术的基础上，对棉铃虫的卵、幼虫、蛹和成虫的饲养器材和操作方法进行了简化和改进。将产于纱布上的卵经消毒晾干后，直接放于塑料保鲜袋中孵化。初孵幼虫用毛笔移入特制的带盖10孔饲养盒，每孔1头，孔径和高度为2.5cm×1.8cm，接虫前每孔加人工饲料4～5g，接虫后加盖，直至化蛹。幼虫化蛹后用培养皿收集，直接放于成虫饲养笼中，任其羽化、交配和产卵。采用这一改进饲养技术，幼虫存活率、化蛹率、羽化率等均有显著提高，棉铃虫的病害明显减少，同时节约饲养成本约50%。 棉铃虫的饲养方法 培养容器：24孔细胞培养板 感染饲料配方：酵母粉 4.0 g 黄豆粉 7 g 维生素C 0.5 g 青霉素 1 g 36%醋酸 1.25 mL 琼脂 1.5 g 水 100 mL 注意：维生素C与青霉素在使用前再加入，不参与灭菌。 棉铃虫来源：湖北省农业科学院（300元/纱布） 棉铃虫的饲养方法 活虫统计 感染饲养 虫卵孵化 样品准备 结果处理 确定生长时期 确定毒力检测对象 破碎 or 菌体？ 上清 or 沉淀？ 一龄幼虫 饲养7天 处死 刚孵化出的棉铃虫幼虫——初孵幼虫 结果处理 一个培养周期内的成活率/致死率？ LC50、LD50、EC50、IC50 LC50 （Lethal Concentration 50）——半致死浓度：表示杀死 50% 防治对象的药剂浓度，单位为mg/L。 LD50 （Lethal dose 50）——半数致死量 ：表示杀死50%实验动物的毒物剂量，毒理学常用参数，单位为mg/kg。 EC50 （Effective Concentration 50）——半数有效浓度：表示50%试验生物对毒物产生药理反应的浓度，越低越好。 IC50（Inhibitory Concentration 50） ——半数抑制浓度：表示50%反应被抑制时的浓度，越低越好，多用于抗菌抗病毒。 生长状态：特定的体征（如体长、体重），进食量，排泄量 常见问题及注意事项 未孵化的虫卵可在冰箱中保存一个月； 预实验：要做好正式感染实验之前的预实验，特别是对样品浓度的确定。对于毒力过高或过低的样品，可先设置3个相差较大的浓度梯度以确定毒力范围。根据实验经验，转入cry1Ac10的菌株在培养到芽胞期时，感染样品稀释倍数应大于1000倍； 正式感染实验应设置阴性对照（用ddH2O或大肠杆菌饲养）； 注意避光和饲养器皿的封闭性：成虫在产卵时具有趋光性，需要增加必要的光照。幼虫生长需要一定的光照时间，但在一般检测毒力和病毒复制过程中，则不需要光照。棉铃虫幼虫具有互相残杀的特性，在饲养过程中要注意虫与虫的隔离。