心水通复方水提物对缺氧诱导心肌细胞AQPs影响的分析.pdfVIP

1．1试剂…………………………………………………………………………………………．15 1．2仪器………………………………………………………………………………………………………………………一16 2方法………………………………………………………………………………………………一16 2．1常用溶液配制……………………………………………………………¨………………．16 2．2Real—time PCR检测AQP-1、4、7基因表达……………………………………………．16 2．3细胞免疫组织化学法检测AQP．1、4、7蛋白表达………………………………………18 2．4Western Blot法检测AQP．1、4、7蛋白表达………………………………………………19 2．5统计学分析…………………………………………………………………………………．20 3结果………………………………………………………………………………………………一20 3．1 3．2细胞免疫组织化学法检测AQP．1、4、7蛋白表达………………………………………21 3．3Western Blot法检测AQP．1、4、7蛋白表达………………………………………………25 4讨论………………………………………………………………………………………………………………………………一27 5结论………………………………………………………………………………………………．．28 参考文献……………………………………………………………………………．29 附录…………………………………………………………………………………34 致谢……………………………………………………………………………………………………．．35 文献综述……………………………………………………………………………．36 作者简历……………………………………………………………………………．41 Ill 万方数据 中文摘要 目的： 通过借助体外细胞，研究心水通复方水提物对AQPs基因、蛋白表达与细胞线粒体 和病理形态变化之间的关系，试图揭示该组方防治CHF的作用机制。 方法： · 通过体外缺氧再复氧诱导人心肌细胞，不同浓度心水通复方水提物干预人心肌细 胞。运用MTT法、流式细胞术、激光共聚焦、细胞特殊染色、Real-timePCR、细胞免 疫组织化学法和Westernblot法，检测细胞活性、细胞损伤和线粒体的变化，以及AQP-1、 4、7基因和蛋白的表达之间的关系。 结果： 组的细胞存活率高于模型组，具有显著性差异泸0．05)。 2、流式细胞术检测线粒体膜电位变化及激光共聚焦观察JC．1染色结果显示，模型 组细胞线粒体膜电位明显降低，与正常组相比有显著性差异妒0．05)。心水通复方水提 物组中XST-400组线粒体膜电位高于模型组且有显著性差异(尸O．05)。 Red染色结果显示，模型组溶酶体红色光比值明显降低，与正常组 3、Lysotracker 值均高于模型组，与模型组相比均有显著性差异(尸0．05)。 4、Real．time u 达比正常组显著增高(尸O．05)。在心水通复方水提物200g／ml--600u酌：Ill范围内， ll AQP．1mRNA的表达水平随着浓度增加而增高：而在XST-400 u u 的表达明显比200g／ml和600g／ha降低(P0．05)，其原因有待进一步研究。 5、细胞免疫组织化学结果显示，在人心肌细胞中均可以检测到AQP一1、4、7蛋白 的表达。经过缺氧再复氧人心肌细胞模型组中AQP．1、4、7蛋白表达上调，模型组阳 性细胞较正常对照组增多，且模型组积分光密度高于正常对照组(尸O．05)。在心水通