免疫组织化学技术---上海交通大学医学院精品课程.pptVIP

免疫组织化学技术 何谓免疫组化 免疫组织化学是将免疫学基本原理与细胞、组织化学技术结合所建立起来的技术。应用抗原抗体可发生特异性结合的免疫学基本原理，采用带显色剂的特异性抗体（抗原）在组织或细胞原位显示相应的抗原（抗体），确定某些抗原（抗体）是否存在于细胞、组织内并检测其分布情况，由此对某些抗原（抗体）进行定性、定位及半定量检测的一项技术 发展历史 这项技术本质上是一种染色及原位示踪技术，它是在酶组织化学基础上发展起来的，始于20世纪中期 免疫试剂，自1975年Kohler和Milstein发明了单克隆抗体制备的杂交瘤技术后，已从采用多克隆抗体转入了广泛应用单克隆抗体时代。目前商品供应的特异性第一抗体和交联第二抗体，绝大多数都为单克隆抗体 技术特点（优点） 1．特异性强 专一 2．敏感性高 检测阈值达ng或pg水平 3．定位准确 即可定性、定位， 又可定量 4．三位一体 形态、功能和代谢三结合 缺点：干扰多，易出现假阳性 ? 免疫组织化学染色操作步骤 （一）?组织处理与切片选择 （二）免疫染色的前处理 试剂准备（示踪，放大，标记）；消化；阻断； （三）免疫组化染色 （四）免疫染色的后处理（ 增强、衬染、封固） 标本的处理 标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞 标本的固定与保存 酶消化处理 标本的固定与保存 标本的固定与保存 标本的固定与保存 抗原处理（酶消化/热修复处理） 抗体处理与保存 免疫染色 标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物； 用缓冲液冲洗去未结合的成分； 直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接法），或待标本显色后再用显微镜观察结果（免疫酶直接法） 设立对照实验 免疫组化的结果判断 几种常用的免疫组化检测技术 荧光免疫组织化学技术 酶免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术 免疫标记电镜技术 …… 免疫组化在临床病理诊断中的应用 标记淋巴造血组织及其肿瘤的细胞来源和细胞分化程度; 协助肿瘤良恶性的诊断; 鉴别低分化癌和肉瘤; 鉴别转移癌的性质; 协助发现骨髓、淋巴结微小转移癌灶; 鉴别小细胞恶性肿瘤; 癌组织耐药基因的检测; 为癌症患者治疗方案的拟定提供依据; 确定肿瘤组织的增殖活性; 评估癌症患者的预后; 检测病原体。 免疫电镜技术 免疫电镜技术又称电子显微镜免疫细胞化学技术。是免疫细胞化学与电镜技术相结合的产物，即在电镜下对细胞内抗原做定性或定量的研究。其中免疫铁蛋白技术，免疫胶体金技术，免疫酶细胞化学技术等，皆为常用技术 免疫细胞化学技术——细胞水平（光镜分辨率） 电镜免疫细胞化学技术——超微结构水平 （电镜分辨率） 缺点：经过一系列染色步骤，易损伤结构。 应用：特别适用于含抗原量较少的组织。 （二）免疫染色 1. 包埋前染色：即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、包埋。 优点： ① 抗原不易被破坏，易于获得良好的免疫反应。 ② 可在免疫反应阳性部位定位做超薄切片，检出率↑。 2.包埋后染色： 组织标本经过固定脱水及树脂包埋、制成超薄切片后，再进行免疫组化染 色。由于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色，故又称载网染色（on grid staining ）。 优点： ① Ultrastructure 保存良好。 ② 超薄切片易穿透，可标记细胞任何部位。 ③ 方法简便，（+）结果高度可重复性。 ④ 同一张切片上可进行多重免疫染色。 缺点： ① 抗原活性可能减弱或消失。 ② 树脂中的组织不易进行免疫反应。 3．超薄冰冻切片： T→2.3mol/L（蔗糖）→液氮速冻→冰冻超薄切片上切片（厚于光镜片） （三）包埋 1．树脂包埋 2．低温包埋 K4 M ： 单体 ， 17.3％； 支联体 ， 2.70g； 引发剂， 0.10g。 （四）免疫电镜包埋前染色——前法 ① 4％多聚甲醛（0.05MPBS，PH7.2）原位固定，4℃，1h 0.05M PBS 充分洗—前 处理 ② 0.05M PBS 充分洗—前处理。 ③ PAP或ABC染色系列过程呈色。 ④ PBS洗5′×　3次。 ⑤