生物化学实验-DEAE纤维素离子交换层析法分离血清蛋白.ppt

实验八 DEAE纤维素离子交换层析法分离血清蛋白 实验目的 1. 掌握DEAE纤维素离子交换层析法分离血清蛋白的原理与方法。 2. 熟悉762紫外分光光度计的使用。 思考题 DEAE离子交换层析根据什么原理分离蛋白质？ 为什么要预处理DEAE？ 什么叫阳离子交换剂？阴离子交换剂？ 通过DEAE纤维素32离子交换层析法分离血清蛋白所得收集液第一个蛋白高峰主要是哪一种蛋白？为什么？ 实验原理 离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。 平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。 DEAE纤维素(二乙基氨基乙基，Dicthylaminoethyl，DEAE)是阴离子交换剂。在pH8.0的溶液中，血清蛋白质都解离成为阴离子，可交换结合到DEAE纤维素离子交换层析柱上。 然后用梯度洗脱法，即逐步改变洗脱液的pH值与离子强度使DEAE纤维素与蛋白质的亲和力降低，可使不同蛋白质按其亲和力的大小不同而分步洗脱下来，从而达到分离提纯的目的。 762分光光度计、梯度发生器、磁力搅拌器、量筒、漏斗、烧杯、试管、乳头吸管、移液管、玻璃棒、尼龙布、螺旋夹。 实验器材 DEAE纤维素-32、0.01mol/L Na2HPO4(pH8.0)、0.5 mol/L NaH2PO4(pH4.0)、0.5N NaOH、0.5N HCl。 实验试剂 实验操作 取2.5g DEAE纤维素-32，轻洒在盛有40ml 0.5N HCl的烧杯中，用玻璃棒轻轻搅拌使纤维素粉下沉，浸泡30分钟，加69ml蒸馏水，用玻璃棒搅拌，静置10分钟，弃上层液体，重复加水、搅拌、弃上清步骤1~2次，使上清液体没有细的混合物，然后倾入有尼龙滤布的漏斗中。用蒸馏水充分洗涤，直到流出液pH≥4（用pH试纸检查）。 1、DEAE纤维素的处理 将纤维素放到250ml的烧杯中，加40ml 0.5N NaOH浸泡30分钟，弃上清。加蒸馏水100ml，搅拌后倾入有尼龙滤布的漏斗中。用蒸馏水充分洗涤，直到流出液pH≤8，滤去水分。 将上述纤维素放入250ml烧杯中，加入100ml 0.01mol/L Na2HPO4浸泡并搅动。必要时再重复此操作到溶液pH=8为止。 实验步骤 3、安装梯度发生器 2、装柱 先将小尼龙布盖在胶塞上，然后插在玻璃管底部，一定不能让尼龙布漏出来。将纤维素离子交换树脂加上缓冲液，不要太浓稠，搅拌均匀，尽量一次性到入柱子里，不要带入气泡，形成均一的柱床，上表面要平整，下面滴管打开，排掉填料里的水。 拧紧夹子，往带有出口的烧杯中加0.01mol/L Na2HPO4(pH8.0)溶液，另一个烧杯中加0.5 mol/L NaH2PO4(pH4.0)溶液。将梯度发生器放在磁力搅拌器上，搅拌子放在带有出口的烧杯里，胶管充满液体排气泡拧紧螺旋夹。 4、加样 当液面恰好与凝胶面重合时，立即拧紧螺旋夹，用枪向界面缓慢的加入血清0.2ml，打开柱下口，液体缓慢流出。 当全部血清恰好完全渗到纤维素柱界面时，立即小心地加0.01mol/L Na2HPO4 缓冲液0.5ml。连上乳胶管胶塞。 平衡液 界面 分离介质 5、洗脱 拧松梯度发生器盛液桶间的螺旋夹。开动磁力搅拌器，（搅拌速度不宜过快，以免空气卷入液内）。将连接梯度发生器出口的细胶管连接管上，使液体流入层析管内。 拧松层析柱下端胶管的螺旋夹，控制流速约15滴/分，使洗脱液滴入收集管内。每管收集到约3ml，换管。收集完为止（15~20个管）。 6、检测 用分光光度计测280nm光密度值（以0.01 ml/L Na2HPO4液作空白管）。 以光密度为纵坐标，管号为横坐标，用方格坐标纸绘出血清蛋白层析谱。观察并判断结果。 注：洗脱开始时先用1个体积的0.01mol/L Na2HPO4起始（100ml）洗脱，然后再进行梯度洗脱，加样后即开始收集，每管约3ml。 7、作图 8、实验结束后，40 ml pH8.0缓冲液清洗，用pH试纸检测，pH8.0终止。 结 束 ！ * * * *