外源基因的表达和转基因生物的鉴定.pptVIP

第八章 外源基因的表达和转基因生物的鉴定 第一节 外源基因在受体中的表达 一、外源基因在受体中表达的一般特征 （三）、真核基因在原核细胞中的表达 存在困难： （四）原核基因在真核细胞中的表达 二、原核细胞高效表达外源基因 可以通过两步亲和层析来进行纯化： 2、外源蛋白的分泌表达 外源蛋白在大肠杆菌的分泌表达的四大好处： (2)存在于周质 （3）存在于胞外 3、通过减轻宿主细胞的代谢负荷 （1）基因产物的诱导表达 三、外源基因在植物中的表达 1、同源性表达和异源性表达 2、瞬时表达和稳定表达 3、组成型表达和发育特异性表达 4、条件诱导表达 （1）热诱导表达 第二节 转基因生物的鉴定 一、个体水平鉴定 1、胭脂碱和章鱼碱检测 2、新霉素磷酸转移酶（NPT-Ⅱ）基因 3、氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因 4．潮霉素磷酸转移酶（HPT） 5、β-葡萄糖酸苷酶（GUS）基因 6、荧光素酶（LUC）基因 7、绿色荧光蛋白（GFP）基因 8、二氢叶酸还原酶（DHFR）基因 9、抗除草剂Basta（bar）基因 三、分子水平鉴定 * * （一）原核基因在原核细胞中的表达 转录：需强启动子 翻译：（1）起始密码子 （2）SD序列 （二）真核基因在真核细胞中的表达 只要外源基因与受体组织具有相同的基因表达系统，就可在宿主细胞中表达，更确切地说，只要外源基因具有真核基因特有的启动子及其它控制序列，则它们就能正常表达。 ①原核细胞RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。 ②由于真核基因为不连续基因，因而必须将内含子切除后才能成为成熟的mRNA，但原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。 ③在原核细胞中，mRNA必须含有SD序列才能和核糖核蛋白体结合，从而指导蛋白质的合成。而真核基因转录的mRNA缺少SD序列。 ④真核基因在原核细胞表达产生的外源蛋白很不稳定，容易被细胞蛋白酶所破坏。 原核基因在真核细胞中的表达主要是表达产物的剂量问题，剂量较少又是因为原核基因组和真核基因组的结构特征有差异，因而有表达障碍。 1、形成融合蛋白 融合蛋白 N端：由原核DNA序列编码， C端：由真核DNA的完整序列编码。 （1）将含有融合蛋白的粗制样品，通过特定的亲和层析柱，使融合蛋白和柱上的配基进行亲和作用而吸附到层析柱上，将杂蛋白洗净后，再将融合蛋白洗脱下来。 （2）将纯化的融合蛋白进行化学或酶法裂解后，再上同样的亲和层析柱，此时融合伙伴蛋白或亲和柄吸附到柱上，而流出液则含有纯化的目标蛋白。 外源蛋白可能积累的方式有三种，即出现于细胞质、周质及细胞外培养基中。 （1）存在于细胞质 容易形成包含体，蛋白质已经折叠了，纯化后再折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性。 （1）可以简化发酵后的纯化工艺。 （2）保证表达的外源蛋白具有正确的天然一级结构。在大肠杆菌中表达的外源蛋白很多都保留有N端的Met，Met的存在就可能影响到表达蛋白的生物活性或免疫原性。通过基因设计，就可以去除Met。 （3）外源蛋白生物活性的高低，依赖于蛋白的正确折叠，而分泌表达设计，有利于正确构象的形成。 （4）将外源蛋白分泌到周质或培养基中，就减少了外源蛋白被蛋白水解酶降解的机会，可提高蛋白的回收率。 由于周质中蛋白种类少，目标蛋白纯化较为简单； 蛋白酶解程度不甚严重； 促进二硫键的形成及蛋白质的折叠作用； 蛋白质N-末端结构真实。 蛋白质酶解作用最低； 目标蛋白容易纯化； 增进了蛋白质的折叠作用； 蛋白质N-末端结构真实。 该方法是当宿主细胞大量生长时，抑制外源基因的表达；而当宿主细胞的生物量达到饱和时，再诱导外源基因的表达。 例：温度敏感的转录调控蛋白λcI857 （2）表达载体的诱导复制 该方法是在宿主细胞大量生长时，抑制重组质粒的复制；而当细胞生物量积累到一定水平时，再诱导细胞中重组DNA的复制。 带有质粒的大肠杆菌HB101 质粒拷贝数 相对生长速率/% 无 0 1.00 A 12 0.92 B 24 0.91 C