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实验二、离心技术及物质代谢实验 一、离心技术 【概念】 根据物质沉降系数、质量、浮力因素等的不同，应用离心力使物质分 离、浓缩、提纯的方法。 【应用】 分离、提纯、鉴别生物高分子；分离线粒体、染色体、微粒体、溶酶 体等亚细胞物质。 【基本原理】 1、 离心力 2 n ?rpmm?4 n 2?转速 2?rF=m?a=m?o r, w=, F= 6036002 F：粒子在离心场中所受的离心力 a：粒子旋转的加速度 m：沉降粒子的有效质量 3：粒子旋转的角速度 r：粒子的旋转半径(cm) 2、 相对离心力 相对离心力：离心力相对于重力的倍数，单位是g Fmau)2r RCF===Gmg980 RCF(relative centrifugal force):相对离心力 rpm( revolutions per minute ): 每分乍中转速 低速离心时常以转速“rpm”來表示 高速离心时则以“g”表示 3、沉降系数(S) 物质在单位离心力场下的沉降速度。 S=drl?2 dtu)r 单位：Svedberg, 1S=1OA-I3s 另外，对某些生物高分子或亚细胞器组分的化学结构、分子量尚不了 解时， 可用沉降系数对其物理特性进行初步描述，将其区别开來，如原核生 物的核蛋白体RNA (rRNA)分为5S、16S、23S,即是根据其在离心场中的 行为来进行分类。 【离心机的类型和主要构造】 1、 类型 普通离心机：lt; 6000rpm 离心机 制备性离心机 高速离心机： 6000~20000rpm 超速离心机：2 20000rpm 实验用离心机 2、 主要构造 转头，离心管和管帽，制冷系统，真空系统，制动装置，指示表盘 【离心操作的注意事项】 1、使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内 容物，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必 须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。 2、 每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使用转头时要查 阅说明书，不得过速使用。 3、 装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离 心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得 过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀;而制备性超速离 心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上 部凹陷变形。 4、 若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或 置于离心机的转头室内预冷。 5、 离心过程中不得随意离开 二、物质代谢实验 【胰岛素对血糖含量的影响及测定】 1、 实验目的 （1） 通过实验方法证实胰岛素对血糖含量的降低作用，即检测家兔 注射胰岛素前后血糖浓度的改变。 （2） 掌握邻甲苯胺法测定血糖浓度的方法。 2、 实验原理 （1）胰岛素降血糖的机理 促进肌肉、脂肪组织对葡萄糖的通透性，促进葡萄糖进入这些细胞; 糖原合成仁糖原分解!; 糖有氧氧化f ； 磷酸烯醇式丙酮酸竣激酶合成I -糖异生I ; 激素敏感性脂肪酶I-脂肪动员I0 （2） jflL糖测定（邻甲苯胺法） 葡萄糖 脱水形成（含有硼酸的冰醋酸）水浴加热至100°C,浓酸溶液邻 甲苯胺 轻甲基咲喃甲醛（疑甲基糠醛）蓝绿色化合物（630nm） 3、实验方法 （1）胰岛素对血糖含量的影响：家兔注射胰岛素前后血糖含量的变 化。①取饥饿12小时家兔一只，记录体重. 采取血标本：用二甲苯棉球涂擦家兔耳部，使局部血管扩张，然后 用刀片纵行切开边缘耳静脉，让血液自然滴入试管屮，收集约2ml ,待血凝固后，分 离血清（3000rpm, 5min,离心后转移上清至一新离心管）. 按家兔体重，腹腔注射1.5单位/kg胰岛素，记录注射时间，待40 分钟后，用同样方法取血，分离血清. 将注射胰岛素前后的血清，分别测定血糖含量。⑤注意事项 （a）家兔己经饥饿12小时，在采血和注射胰岛素时动作尽量温和。 （b）取耳缘静脉要用刀片纵向割开，从尖部到根部 （c） 首次接触使用离心机，离心机使用时一定要配平，并对称放置。 受离心机内空间限制，取血要用短试管。 （d） 试管一定做好标记。（2） JflL糖含量的测定①取长试管四支, 按下表操作 ②混匀，置沸水浴中加热10分钟，取出立即置冷水中冷却. ③用630nm波长，以空白管校止吸光度为0,分别测定各管吸光度 值.标准液：0.490注射前：0.641注射后：0.319④计算 （测定管吸光度/标准管吸光度）*标准液浓度*100二血糖（mg/100ml） 注射前：130.81mg/100ml 注射后:65.10mg/100ml 标准液： 葡萄糖标准液 0.1 mg/ml 正常参考范围 3.9~6.1mmol/L （人） 130mg/100ml （兔） 【糖酵解中