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实验二萌发小麦水溶性蛋白含量测定预习报告 生物化学实验预习报告 实验二酶活力测定方法的研究（2） 萌发小麦水溶性蛋白含量测定 一、研究背景 酶比活力（性）是指在特定条件下，单位重量（mg）蛋白 质（或RNA）所具有的酶活力单位数。比活力（Specific Activity）是酶纯度的量度, 般用IU/mg蛋白质来表示, 通常酶的比活力越高，酶就越纯。人们利用比活力的大小来 比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，作为酶纯度高低 的一个重要指标。 在实验一中，我们学习并掌握了蛋白质含量的基本测定方 法及分析，实验二的第1部分我们又测定了酶的活力，学习 了定量检测某种酶的策略和方法。在本次实验中，我们依然 通过分光光度法测定蛋白质的含量，结合酶活力的测定结 果，便可得出酶的比活力，从而对特定生物样品的单位质量 蛋白质中特定酶的催化能力有一个初步的认识。 二、研究目标 1.进一步熟练使用分光光度法测定蛋白质浓度； 2?掌握酶比活力测定的一般思路及方法； 3?测定萌发小麦（X?淀粉酶与卩?淀粉酶的比活力。 三、研究策略 首先测定出（X?淀粉酶与卩?淀粉酶的活性（实验二第1部分 已测），然后采用Folim酚法测定出水溶性蛋白的总含量，通 过计算便可分别得出a?淀粉酶与卩?淀粉酶的比活力。 四、研究方案与可行性分析 1?研究方案 （1）酶的获取 材料为实验二第1部分所取萌发的小麦种子研磨浸提得到 初始酶液。 （2） 血淀粉酶与卩?淀粉酶活力测定 实验二第1部分已经完成。 （3） 水溶性蛋白总量测定 采用Folin-m法测定水溶性蛋白的总含量。首先配制一系 列浓度由小到大的标准溶液，测定其吸光度值，从而绘制出 标准曲线。随后测定初始酶液的吸光度值，从标准曲线上即 可读出初始酶液中蛋白质含量。 （4）酶比活力的计算 酶的比活力（U/mg ）=酶活力（U/mL ）/蛋白浓度（mg/mL ） 2?可行性分析 就实验本身而言，通过测定酶活力以及总蛋白含量计算酶 的比活，方案合理，简便易行，具有可操作性；实验材料（萌 发小麦种子）可在实验室获得，Folin-酚试剂甲和乙、分光 光度计实验室均可提供；实验所用时间约为4h（下文会粗略 计算），可在规定时间内完成，故时间上有可行性。综合以 上各点，本实验具有可行性。 五、具体实验设计 1?实验仪器及试剂 722型光栅分光光度计、具塞刻度试管、微量可调手动移 液器、蒸馅水、Folin■酚试剂甲、Folin?酚试剂乙、标准牛血 清白蛋白溶液（lmg/ml BSA）＞待测样液（初始酶液） 2?实验步骤 （1）待测样液（初始酶液）的制取（实验二第1部分已做, 30min) （2） a■淀粉酶与卩?淀粉酶活力测定（实验二第1部分已经 完成，2.5h） （3） Folin-酚法测定水溶性蛋白的总含量 ol250ng/ml BSA 的配制（lh） 用移液器量取lmg/ml BSA3ml,随后加入9ml蒸馅水，颠 倒之后混合均匀即可。2 规定淀粉酶的活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生 成的麦芽糖毫克数（mg麦芽糖min?lg?l鲜重），即lU=mg 麦芽糖min-lg-1鲜重。 a?淀粉酶的比活力（U/mg） = a■淀粉酶活力（U） /［初始酶 液体积（ml） x蛋白浓度（mg/mL）］ 卩?淀粉酶的比活力（U/mg）=卩?淀粉酶活力（U） /［初始酶 液体积（ml） x蛋白浓度（mg/mL）］ 3?注意事项及误差分析 Folin■酚法测定蛋白质含量时，由于反应的显色随时间不断 加深，因此各项操作必须精确控制时间。另外，加入试剂乙 后应该立即混匀，以便在磷钳酸一磷钩酸试剂被破坏之前还 原反应即能发生，否则会造成测量误差，使其OD650下降, 测定结果偏低。 六、质疑与思考 本实验在测定水溶性蛋白质含量时，为什么要选用Folin- 酚法？ 在实验一我们用三种不同的方法测定了生物材料中蛋白质 的含量，最终的结果其实相差比较大，但我们也不能够断定 到底哪一种方法是准确的。在本实验中，由于核酸等物质的 干扰，紫外法测定蛋白质含量的结果必定会受到较大的影 响o但为什么本实验不用考马斯亮蓝（G-250 ）法而使用Folin- 酚法呢？生化课本上说Folim酚法是测定可溶性蛋白的标准 方法，但我们知道，Folin?酚法操作费时且抗干扰能力很差, K+、Na+ Mg2+离子、Tris缓冲液、蔗糖、甘油、毓基乙 醇、EDTA等均会对其产生干扰，而K+、Na +、Mg2+这 些离子在生物体内含量也是比较高的，肯定会对测定结果的 准确性有一定的影响。相比较而言，考马斯亮蓝（G?250） 法灵敏度更高，操作快速简便，抗干扰能力强，应该具有更 强的可选择性。 1考虑到试剂等的问题，或许实验室缺少考马斯亮蓝个人 猜想可能会有这些原因：o