Training1 蛋白质组学样品处理技术.pptx

蛋白质组学样品前处理技术 内容概括 I iTRAQ定量蛋白质组学样品制备流程 样本类型 样本量 注意事项 样品需-80℃或液氮保存，干冰寄送 I I 蛋白质组学样品准备 释放 机械 物理 化学 溶解 水化膜 等电点 亲水性 防降解 抑制剂 低温 II 蛋白质组学样品蛋白提取 液氮研磨 裂解 超声破碎 离心除杂 液氮研磨 破碎样品（组织匀浆器、温差、去垢剂） 裂解 尿素等变性剂；SDS等去污剂；DTT等还原剂； EDTA、PMSF、Cocktail等蛋白酶抑制剂 超声破碎 破碎细胞、促进蛋白溶解 离心除杂 高速离心，去除组织细胞碎片等非溶解性杂质 II 蛋白质组学样品蛋白提取 裂解 超声破碎 离心除杂 裂解 尿素等变性剂；SDS等去污剂；DTT等还原剂； EDTA、PMSF、Cocktail等蛋白酶抑制剂 超声破碎 破碎细胞、促进蛋白溶解 离心除杂 高速离心，去除组织细胞碎片等非溶解性杂质 II 蛋白质组学样品蛋白提取 II 蛋白质组学样品蛋白提取 血清制备 高丰度蛋白去除 浓度恒定：65-85 mg/mL 动态范围广：10-12个数量级 目标蛋白丰度低 大量高中丰度蛋白 方便获取检测方便 寻找疾病标志物的最佳样品 血清蛋白浓度动态范围示意图 II 蛋白质组学样品蛋白提取 白蛋白 IgG 抗胰蛋白酶 IgA ProteoExtract Albumin/IgG Removal  Merck Millipore ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Sigma-Aldrich ProteoMiner Multiple affinity removal columns (MARC)1,2,6,7,14 Bio-Rad Aglient Seppro®技术：IgY14和SuperMix Sigma-Aldrich 转铁蛋白 触珠蛋白 Top 12 Abundant Protein Depletion Spin Columns Pierce Pierce Top 2 Abundant Protein Depletion Spin Columns II 蛋白质组学样品蛋白提取 蛋白初步纯化 蛋白沉淀(TCA/丙酮) 蛋白抽提(苯酚抽提) SDS III 蛋白酶解 还原 烷化 酶解 IV 蛋白标记 IV 蛋白标记 V 肽段脱盐组分分离 High pH C18 RP Column S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 V V 肽段脱盐组分分离 I iTRAQ定量蛋白质修饰组学样品制备流程 K(Me Ac Pr Ma Bu Su Cr Hib Ub) R(Me) S(Ac Ph) T(Ac Ph) Y(Ph) H(Ph) iTRAQ定量蛋白质修饰组学样品制备流程 ProteinA/G Agarose Bead VII I iTRAQ定量蛋白质修饰组学样品制备流程 VI VI SILAC定量蛋白质组学样品制备流程 Lysine K H2N— CH— COOH | CH2 | CH2 | CH2 | CH2 | NH2 α β γ δ ε SILAC定量蛋白质组学样品制备流程 蛋白胶点胶条鉴定： 考染蛋白胶点胶条 凝胶脱色 蛋白胶内酶解 肽段萃取 肽段鉴定MALDI-TOF/TOF 胶条混合物鉴定： 蛋白混合液 SDS胶内酶解 LC-MS/MS IP蛋白混合物鉴定：参考胶条鉴定项目 蛋白沉淀 液体酶解 蛋白脱盐 LC-MS/MS 其它蛋白鉴定项目样品制备流程 谢谢！ 其它蛋白鉴定项目样品制备流程