分子生物学技术第五章核酸扩增技术.pptVIP

* * 图6-7 LCR示意图 变性，然后降温退火，引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，DNA连接酶即可连接封闭这一缺口，则LCR反应的三步骤(变性-退火-连接)就能反复进行，每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模板，使更多的寡核苷酸被连接与扩增.若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物. * * 分支DNA信号放大系统--bDNA(branchedDNA)技术 支链DNA(bDNA)技术是由Chiron公司推出的一种不依赖PCR的核酸放大定量方法。将血清HCV RNA与包被在固相板上的探针杂交，固定后加入多个靶探针分别与HCVRNA5’非编码区和核心抗原区的不同位点杂交，放大信号数十倍，然后加入bDNA扩增子，与各靶探针结合，每个扩增子提供多个酶探针结合位点，这样每个核酸信号得以放大数百倍。最后通过底物dixetane发光检测，发光量强弱与DNA量成正比。 * * * * 只有两条目标探针要设计，其它探针都可以模块化。 目标检测片段不会进行数量扩增。 样本处理十分简单，不需要纯化ＤＮＡ。 避免了扩增产物的污染问题。 避免了ＰＣＲ抑制因素可能带来的假阴性问题。 试剂无需冷藏保存。 采用仪器或照相机检测化学发光。 可高通量进行检测不同病原体。 bDNA检测技术特征 * * 链置换扩增术（strand?displacement?amplification,SDA）是近几年发展起来的一种酶促DNA体外等温扩增方法。在靶DNA两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶继之延伸缺口3’端并替换下一条DNA链。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。 其基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。其基本过程包括准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环三个阶段 * /chemistry/laureates/1993/mullis-lecture.html /chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65. * * 原位PCR（in situ PCR） 原位PCR技术是PCR技术和原位杂交技术结合的产物。 基本过程是，先用合适的固定剂（通常为甲醛固定剂如中性甲醛）对组织或细胞进行固定，然后用蛋白酶对细胞进行通透处理，以确保PCR试剂进入细胞并同靶序列接触，最后对DNA和RNA进行细胞内原位扩增。然后进行产物分析并用显微镜观察结果。 * * 定量PCR（Quantitive Polymerase Chain Reaction，QPCR） 广义概念上的定量PCR是指通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板进行定量的技术。 指数扩增期 * * 第二节 荧光定量PCR技术 * * 实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 * * 常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 * * * * 定量原理 介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析 * * 扩增曲线 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）； 纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件 * * * * 荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 真正的信号:荧光信号超过域值 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般