分子生物学技术第10章感染性疾病的分子诊断.pptVIP

HIV-1感染后病毒标志物的变化 第一节 病毒的基因检测 窗口期： 检测抗体 2-12周 检测p24抗原 2-3周 检测RNA 11天 HIV检测 HIV抗体检测（窗口期测p24抗原，可辅助诊断 ） 初筛试验：酶联免疫吸附试验（ELISA） 试纸（金标试纸，双抗原夹心法） 最短在感染6天之后就可以检测到 确认试验：免疫印迹（Western blot, WB） HIV RNA 测定（RT-PCR） 第一节 病毒的基因检测 扩增位置 HIV基因检测中部分常用的引物序列 扩增片段大小 gag基因 5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’ 342 5’-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3’ gag基因 5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3’ 115 5’-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3’ pol基因 5’-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3’ 360 5’-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3’ HIV病毒载量（HIV RNA 定量） 主要有三种技术： RT-PCR（最低检测限为50copies/ml ） bDNA（最低检测限为50copies/ml） NASBA（最低检测限为20 copies/ml） NASBA（nucleic acid sequence-based amplification） 基于核酸等温扩增技术 PCR检测前病毒DNA，对出生48h内婴儿的检测敏感性为38%，出生14d婴儿的检测敏感性可为93% 第一节 病毒的基因检测 方法 检测范围 实验内标准差（lg） 抗凝剂 RT-PCR 4?102-5 ? 0.15 ? 0.33 ACD/EDTA bDNA 4?102-5 0.08 ? 0.33 EDTA NASBA 4?102-5 0.13 ? 0.33 ACD/EDTA/HEP 分子诊断技术在很大程度上改变了感染性疾病的诊断方法 适用于检测不能或不易培养、生长缓慢的病原微生物，如结核分枝杆菌、苍白螺旋体、病毒等； 通过检测细菌16SrRNA基因或对其测序，对细菌进行种属鉴定，并可能发现新菌种； 进行病原体感染的早期诊断，确定感染病原体的类型； 通过对病原体核酸的定量检测动态监测疾病进展； 进行病原体感染的分子流行病学调查； 对病原体进行基因分型； 检测病原体的耐药基因等，为临床诊治、疗效观察提供科学依据，避免了病原体传统检测技术的缺点，避免了血清学检测的不足，如血清学检测的“窗口期”问题，具有快速、特异、灵敏度高等优点。 第一节 病毒的基因检测 病毒感染的潜伏期（窗口期）血清中并无抗体的存在，无法以免疫学的方法来检测 PCR检测病毒量的变化上，比传统的方法更快速，有更高的特异性及灵敏度 Culture 免疫荧光 ELISA Probe PCR 检测速度 + +++ +++ ++ ++/+++ 灵敏度 +++ ++ ++ ++ ++++ 特异性 +++ ++ ++ +++ ++++ 定量分析 ++ ++ ++ + +++ 方便性 + + +++ + ++/+++ 第一节 病毒的基因检测 分子诊断技术在很大程度上改变了感染性疾病的诊断方法 * There are an estimated 350 million chronic carriers of HBV worldwide. More than 75% of these people live in the Western Pacific and Asian regions. Chronic hepatitis B infection is the ninth leading cause of death worldwide - it is estimated that up to 2 million people die each year as a result of HBV infection. Up to 25% of the 350 million carriers worldwide will die as a result of the consequences of infection, such as liver cirrhosis and liver cancer. References: The World Health Report. WHO 1998. Mast EE, Alter MJ. Epidemiology of viral hepatitis: an overview. Sem Virol 1993; 4; 273-283. Lee WM.