分子生物学技术第四章核酸分子杂交技术.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * cDNA探针的制备由于受RNA酶的影响有一定的难度，曾经限制了其应用。随着反转录试剂盒的商品化，cDNA探针的制备 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 毛细管虹吸原理 转移缓冲液通过滤纸的毛细管上升，形成由下至上的液体流，凝胶上的单链DNA被洗脱并转移到薄膜上，因薄膜的吸附作用而使DNA转移固定在膜上，转移的速度取决于DNA片断的大小和凝胶中DNA片断的浓度 * * * * * 石蜡包埋组织切片 冰冻切片 细胞涂片 培养细胞爬片 第三节 核酸分子杂交技术五、原位杂交-原位杂交材料 * 细胞或组织切片的处理 玻片清洗 组织和细胞的固定 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 预杂交 杂交 杂交后漂洗 结果检测 第三节 核酸分子杂交技术五、原位杂交-基本方法 * 荧光原位杂交（fluorescence in-situ hybridization, FISH）是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术 第三节 核酸分子杂交技术六、荧光原位杂交 * 生物素标记探针与荧光素标记的抗生物素抗体 地高辛标记的抗体与荧光素标记的抗地高辛抗体 氨乙酰基荧光（aminoacetylfluroence,AAF）-改良探针与抗AAF抗血清等 上述的检测系统有直接法和间接法两种，后者灵敏度更高 第三节 核酸分子杂交技术六、荧光原位杂交-荧光素标记检测系统 * FISH技术在染色体分析中的应用 第三节 核酸分子杂交技术六、荧光原位杂交 * 基本原理（夹心） NOS（ N-羟化琥珀酰亚胺酯） 捕获探针 PCR 产物 检测探针 亲和素-HRP 四甲基联苯氨 氨基 生物素 第三节 核酸分子杂交技术微板酶联杂交 * 基因突变的分析 基因表达的研究 基因定位的研究 基因克隆的筛选 核酸杂交的主要应用 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 来源：这类探针来源于某种生物的基因组，多为某一基因的全部或部分序列 制备方法: 基因克隆的方法 聚合酶链反应(PCR) 特点: 克隆在载体中的DNA片段，可无限繁殖，取之不尽 PCR制备探针简便和省时 相对RNA而言，DNA探针不易降解，标记方法也较成熟 第二节 核酸探针一、核酸探针的设计-基因组DNA探针 * cDNA（complementary DNA）：是指与mRNA互补的DNA分子 特点: 不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想的核酸探针，尤其是用于基因表达的研究 排除了RNA酶的影响，现已成为分子生物学实验室的常规实验 第二节 核酸探针一、核酸探针的种类-cDNA探针 * RNA探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高 RNA分子大多以单链形式存在，几乎不存在互补双链的竞争结合 RNA分子中不存在高度重复序列，非特异性杂交少，杂交后未杂交的探针分子水解可用RNA酶去除，本底的干扰低。 RNA探针有易降解和标记方法复杂等缺点，限制了其广泛应用。 第二节 核酸探针一、核酸探针的种类-RNA探针 * 特点 : 探针长度较短（一般为10～50bp） 人工合成（避免天然探针的缺点） 尤其适合点突变的检测 由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱 ，但经过精心设计仍可设计出非常 特异的寡核苷酸探针 第二节 核酸探针一、核酸探针的种类-寡核苷酸探针 * 寡核苷酸探针设计原则 探针长度：一般要求在20～50bp G／C含量为40％～60％ 探针分子中应避免互补序列 避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如GGGG-或 -CCCC- 借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较 第二节 核酸探针一、核酸探针的种类 * 理想的探针标记物应具有以下特点 特异：靶序列特异 稳定：标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂 交特异性、稳定性和Tm值 灵敏：标记物被检测 无毒：标记物对环境污染小，对人体无损伤 简便：操作简单 便易：价格低廉 第二节 核酸探针二、核酸探针的标记 * 1.缺口平移法（双链） 2．随机引物法 （单链） 第二节 核酸探针二、核酸探针的标记-放射性同位素标记 * 3．DNA探针的末端标记   （1）Klenow大片段的末端标记法 第二节 核酸探针二、核酸探针的标记-放射性同位素标记 * （2）T4噬菌体多核苷酸激酶标记法　（polynucleotide kinase，PNK) ，也称5-末端标记法